Klinische Validierung eines Raman-Spektroskops zur Bestimmung des Leberfettgehalts

Derzeit gibt es drei Hauptmethoden zur Beurteilung der Lebersteatose vor der Entnahme der Leber eines verstorbenen Spenders: Nichtinvasive bildgebende Verfahren, Bewertung einer Leberbiopsieprobe durch einen erfahrenen Pathologen und Beurteilung durch einen Transplantationschirurgen.

Bildgebende Verfahren, die derzeit verwendet werden, umfassen Ultraschall (USG), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRI). Obwohl es eine akzeptable Empfindlichkeit aufweist, liefert USG keine reproduzierbaren quantitativen Informationen. Es kann in den meisten Zentren verwendet werden, ist jedoch betreiberabhängig. Ebenso ist die diagnostische Leistung des nicht verstärkten CT-Scans zur genauen Quantifizierung der Steatose unzuverlässig. Die MRT ist hochempfindlich und spezifisch bei der Diagnose von hepatischer Steatose, und es wurde berichtet, dass die Fettquantifizierung mit einem 3,0-T-MRT eine ausreichende Empfindlichkeit bieten kann, um Steatose bei lebenden Leberspenderkandidaten zu erkennen und zu quantifizieren. Diese komplexe Technologie schränkt jedoch ihren Einsatz in der routinemäßigen Organbeschaffung ein.

Die mikroskopische Beurteilung einer Leberbiopsieprobe durch einen erfahrenen Pathologen ist der Goldstandard für die Beurteilung von Steatose. Das Vorhandensein und die Art der Steatose können durch mikroskopische Auswertung festgestellt werden. Der Steatosegrad kann nach internationalen Standards bestimmt werden.

Obwohl sie Goldstandard sind, werden Biopsien nur für 23 % der transplantierten Lebern in den Vereinigten Staaten aufgezeichnet. Da zum Zeitpunkt der Beschaffung nicht immer ein Pathologe verfügbar ist, verlassen sich viele Zentren hauptsächlich auf die Beurteilung der Steatose und der Organqualität durch den Beschaffungschirurgen (d. h. Transplantationschirurg). Während dieser Bewertung wird die Spenderleber nach parenchymalen Texturkriterien wie Grad der Vergilbung (normal, leicht, mäßig, stark) und Festigkeitsgrad (weich, normal; leicht, mäßig, stark) bewertet. Studien, die untersuchten, wie genau ein Transplantationschirurg Leberverfettung vorhersagen konnte, kamen jedoch zu dem Schluss, dass diese Einschätzungen selbst in erfahrenen Händen erheblich irreführend sein könnten.

Da alle diese drei Methoden ihre Grenzen haben, besteht Bedarf an einer bequemen und einfachen Technik, um den Leberfettgehalt vor der Transplantation besser zu beurteilen. Die Raman-Spektroskopie ist eine inelastische Lichtstreutechnik, die empfindlich auf Molekülschwingungen reagiert, deren Symmetrie und Frequenzen für die Art der Atome und ihre räumliche Anordnung einzigartig sind. Die Empfindlichkeit gegenüber diesen Eigenschaften ist die Grundlage seiner Fähigkeit, einen spektralen Fingerabdruck von Molekülen im beleuchteten Bereich bereitzustellen. Es wurde zum Nachweis von Aminosäuren, Nukleotidbasen, Fettsäuren, Sacchariden, Primärmetaboliten und anderen Bestandteilen verwendet, die Proteine, Kohlenhydrate, Fette und DNA/RNA biologischer Gewebe bilden. Es ist eine attraktive Technologie für die Bioanalyse, da keine Probenvorbereitung erforderlich ist.

Die Raman-Spektroskopie wird derzeit zur Verwendung in klinischen Umgebungen untersucht und hauptsächlich zu diagnostischen Zwecken durchgeführt. Es ist derzeit in Kanada zur Hautkrebsdiagnose zugelassen.

Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher Raman-Spektroskopiesysteme. Wir haben kürzlich ein Raman-Spektroskopiesystem mit hohem Durchsatz entwickelt, das kleiner als die anderen, tragbar und robust ist. Es ermöglicht In-situ-Scans von Gewebe mit sehr geringer Erfahrung, die vom Bediener verlangt wird. Dieses System verwendet eine Anregungswellenlänge im nahen Infrarot (NIR), um die Eindringtiefe des Lasers zu verbessern und gleichzeitig die Möglichkeit einer Gewebeschädigung zu verringern. Es liefert Informationen in Form von Raman-Spektren, deren Analyse einen Hauptkomponenten(PC)-Score ergibt.

Dieses speziell entwickelte System konnte Steatose in Mäuse- und Rattenleber genau quantifizieren. Die PC-Scores zeigten eine signifikante Korrelation mit histopathologischen Untersuchungsergebnissen. Da Steatose in menschlichem Lebergewebe ähnliche Veränderungen wie der linke Leberlappen von Mäusen und Ratten aufweist, folgerten wir, dass diese Technik auf dem Gebiet der Transplantation angewendet werden könnte. Die klinische Validierung und die anschließende Anwendung dieser Technik kann Transplantationsspezialisten ein wertvolles Werkzeug liefern, um Echtzeitinformationen über den Schweregrad der Leberverfettung zu erhalten, um die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Ergebnisses zu beurteilen und die Rate der versehentlichen Organverwerfungen zu reduzieren.

ZIEL Das Ziel dieser Studie ist die Validierung der Raman-Spektroskopie (mittels unseres speziell entwickelten faseroptischen Raman-Systems mit hohem Durchsatz) in einem klinischen Umfeld zur Bewertung des Leberfettgehalts. Die in vivo Raman-Spektren (PC-Scores) werden mit den Befunden einer präoperativen bildgebenden Methode (MRT-Fettquantifizierung) und dem aktuellen Goldstandard, der Leberbiopsie (d.h. histopathologische Beurteilung der Leberprobe).

SPEZIFISCHE FORSCHUNGSFRAGEN

1. Kann die Raman-Spektroskopie unter Verwendung eines tragbaren faseroptischen Systems den Fettgehalt der Leber in situ im klinischen Umfeld schnell bestimmen? 2. Korrelieren Raman-Spektren (Hauptkomponentenwerte) gut mit den Befunden der MRT-Fettquantifizierung und der histopathologischen Beurteilung der Leberbiopsieprobe? STUDIENDESIGN: Diese Studie ist als monozentrische, prospektive Validierungsstudie konzipiert.

METHODEN Leberteilresektion ist die chirurgische Entfernung eines Teils der Leber. Die meisten Leberteilresektionen werden zur Behandlung von Lebertumoren durchgeführt. Patienten, die sich in unserer Einrichtung einer offenen Leberteilresektion unterziehen, werden mit dem Pflegeteam überprüft und um Zustimmung gebeten, wenn sie für diese Studie als geeignet erachtet werden.

Ein vom Research Ethics Board der Gesundheitsbehörde von Nova Scotia genehmigtes Einwilligungsformular wird in der Einwilligungsdiskussion verwendet (geführt von dem klinischen Mitarbeiter oder dem wissenschaftlichen Mitarbeiter – beide sind an diesem Projekt teilnehmende Forscher) und den Patienten wird Zeit zum Lesen gegeben vollständig zu dokumentieren, bevor sie um eine Entscheidung über die Teilnahme gebeten werden. Patienten, die der Studie zustimmen, werden der Studiengruppe zugeordnet. Der Zuweisungsprozess wird fortgesetzt, bis 25 Patienten eingeschlossen sind.

Die Studienteilnehmer werden einer präoperativen MRT zur Fettquantifizierung unterzogen. Sie werden gebeten, vor der MRT mindestens 8 Stunden zu nüchtern zu sein. Die Fettquantifizierungstechnik (Protonendichte-Fettfraktionstechnik) wird unter Verwendung der IDEAL-Pulssequenz, die von Health Canada für die Bewertung der hepatischen Fettfraktion zugelassen wurde, auf einem 3,0-T-MR-Gerät (GE 750; GE Healthcare) durchgeführt. Ein am Stipendium ausgebildeter Abdominalradiologe, der Erfahrung in der Interpretation von MR-Bildern hat, wird die hepatische Fettfraktion (FF) auf FF-Karten messen, die automatisch generiert werden. Der automatisch berechnete hepatische FF wird als Prozentsatz auf einer vollen Skala von 0-100 angezeigt.

Während der Leberresektion wird ein Bereich der Probe, der entfernt werden soll, aber nicht die eigentliche Läsion, durch die faseroptische Sonde des Raman-Spektroskops beleuchtet. Die bereitgestellten und in Echtzeit (innerhalb weniger Sekunden) aufgezeichneten Raman-Spektren werden anschließend analysiert (Hauptkomponentenanalyse). Diese Analyse liefert einen PC-Score.

Nach der Anwendung der Raman-Spektroskopie wird der operative Eingriff wie geplant fortgesetzt. Histochemische Färbungen, H&E (Hämatoxylin-Eosin) und Trichrom werden routinemäßig für die Interpretation von Leberproben in unserem Labor für anatomische Pathologie verwendet. Als spezielle Beize muss Oil Red O verwendet werden, um das Vorhandensein und Ausmaß des Fetts (d. h. Fettquantifizierung) im Lebergewebe. Da es nur an Gefrierschnitten durchgeführt werden kann, wird ein Gefrierschnitt aus dem entnommenen Leberprobenschnitt angefertigt, um eine Oil Red O-Färbung zu ermöglichen – spezifisch für die Diagnose und Quantifizierung von Fetttröpfchen. Ein behandelnder Pathologe, der für die MRT-Befunde verblindet ist, wird diese Schnitte auswerten und den Steatosegrad gemäß den internationalen Standards bestimmen:

M0: keine makrovesikuläre Steatose M1: leichte fokale makrovesikuläre Steatose (< 30 % Hepatozyten sind beteiligt) M2: mäßige, zonale makrovesikuläre Steatose (> 30 und < 60 % Hepatozyten sind beteiligt) M3: schwere panlobuläre makrovesikuläre Steatose (> 60 % sind Hepatozyten beteiligt) Für jeden Studienteilnehmer wird eine Korrelationsanalyse zwischen hepatischen FF-Prozentsätzen, PC-Scores und Steatose-Graden durchgeführt. Die Studienteilnehmer werden nach der Operation gemäß unserem Standard-Nachsorgeprotokoll nach Leberresektion ohne Abweichungen vom Behandlungsstandard weiterverfolgt.

STATISTISCHE ANALYSE Für die statistische Analyse werden quantitative Daten als Mittelwerte und Standardabweichungen und qualitative Daten als Zahlen ausgedrückt. Es wird eine lineare Regression zwischen dem Grad der makrovesikulären Steatose und den FF-Prozentsätzen der Leber und den PC-Scores durchgeführt. Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven werden für die PC-Scores und hepatischen FF-Prozentsätze erstellt, um ihre Fähigkeit zu identifizieren, den Grad der makrovesikulären Steatose vorherzusagen. Alle statistischen Analysen werden mit kommerziell erhältlicher Statistiksoftware (XLSTAT 2014) durchgeführt.

Personenbezogene Gesundheitsdaten werden für die Durchführung dieses Projekts nicht verwendet. Codenummern werden für jeden Teilnehmer vergeben. Eine Datenbank, auf die nur die Ermittler zugreifen können, wird auf einem gesicherten Computer (Passworteingabe erforderlich) im Transplantationsbüro (Queen Elizabeth II Health Sciences Centre, Victoria General Site, 4. Stock, Dickson Building, Raum 4074) gespeichert. Diese Datenbank wird die Codenummern der Teilnehmer und die Datenelemente wie z. B. hepatischer FF-Prozentsatz, PC-Score und Steatosegrad enthalten.