Klinisk validering av ett Raman-spektroskop för att bestämma leverfettinnehåll

För närvarande finns det tre huvudsakliga metoder som rapporterats för att bedöma leversteatos innan leverhämtning av avliden donator: Icke-invasiva avbildningstekniker, utvärdering av ett leverbiopsiprov av en erfaren patolog och bedömning av transplantationskirurg.

Avbildningstekniker som för närvarande används inkluderar ultraljud (USG), datoriserad tomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRT). Även om den har en acceptabel nivå av känslighet, tillhandahåller inte USG reproducerbar kvantitativ information. Den kan användas i de flesta centra men den är operatörsberoende. Likaså är den diagnostiska prestandan för icke-förstärkt CT-skanning för korrekt kvantifiering av steatos opålitlig. MRT är mycket känsligt och specifikt för att diagnostisera leversteatos och det har rapporterats att fettkvantifiering med en 3,0-T MRI kan ge tillräcklig känslighet för att upptäcka och kvantifiera steatos hos levande leverdonatorkandidater. Denna komplexa teknik begränsar dock dess användning vid rutinmässig organtillvaratagande.

Den mikroskopiska utvärderingen av ett leverbiopsiprov av en expertpatolog är guldstandarden för bedömning av steatos. Förekomsten och typen av steatos kan bestämmas genom mikroskopisk utvärdering. Graden av steatos kan bestämmas enligt internationella standarder.

Trots att de är guldstandard registreras biopsier för endast 23% av transplanterade lever i USA. Eftersom en patolog inte alltid är tillgänglig vid tidpunkten för upphandling, förlitar sig många centra huvudsakligen på bedömningen av steatos och organkvalitet av inköpskirurgen (dvs. transplantationskirurg). Under denna bedömning utvärderas donatorlevern enligt parenkymala texturkriterier såsom grad av gulhet (normal, mild, måttlig, svår) och grad av fasthet (mjuk, normal; mild, måttlig, svår). Studier som undersökte hur exakt en transplantationskirurg kunde förutsäga leversteatos drog dock slutsatsen att dessa bedömningar kunde vara avsevärt missvisande även i erfarna händer.

Eftersom alla dessa tre metoder har sina begränsningar finns det ett behov av en bekväm och enkel teknik för att bättre bedöma fetthalten i levern före transplantation. Ramanspektroskopi är en oelastisk ljusspridningsteknik som är känslig för molekylära vibrationer, vars symmetri och frekvenser är unika för typen av atomer och deras rumsliga arrangemang. Känslighet för dessa egenskaper är grunden för dess förmåga att tillhandahålla ett spektralt fingeravtryck av molekyler i det upplysta området. Det har använts för att detektera aminosyror, nukleotidbaser, fettsyror, sackarider, primära metaboliter och andra beståndsdelar som bildar proteinet, kolhydraterna, fetterna och DNA/RNA i biologiska vävnader. Det är en attraktiv teknik för bioanalys eftersom ingen provberedning behövs.

Ramanspektroskopi är för närvarande under utredning för användning i kliniska miljöer och den utförs huvudsakligen i diagnostiska syften. Det är för närvarande godkänt för användning i Kanada för diagnostik av hudcancer.

Det finns en mängd olika Raman-spektroskopisystem. Vi har nyligen designat ett Raman-spektroskopisystem med hög genomströmning som är mindre än de andra, bärbart och robust. Det gör att in situ skanningar av vävnad kan utföras med mycket liten erfarenhet som krävs av operatören. Detta system använder "nära infraröd (NIR) excitationsvåglängd för att förbättra laserns penetrationsdjup samtidigt som risken för vävnadsskada minskar. Den ger information i form av Raman-spektra, vars analys ger en Principal Component (PC)-poäng.

Detta specialdesignade system kunde exakt kvantifiera steatos hos möss och råttlever. PC-poängen uppvisade en signifikant korrelation med histopatologiska undersökningsresultat. Eftersom steatos i mänsklig levervävnad uppvisar förändringar som liknar den vänstra leverloben hos möss och råttor, drog vi slutsatsen att denna teknik kunde tillämpas på transplantationsområdet. Klinisk validering och efterföljande antagande av denna teknik kan ge transplantationsspecialister ett värdefullt verktyg för att få information i realtid om svårighetsgraden av leversteatos för att bedöma sannolikheten för ett framgångsrikt resultat och minska antalet oavsiktliga organ som kastas bort.

MÅL Syftet med denna studie är att validera Raman-spektroskopi (med hjälp av vårt specialdesignade fiberoptiska Raman-system med hög genomströmning) i en klinisk miljö vid bedömning av leverfettinnehåll. Raman-spektra in vivo (PC-poäng) kommer att jämföras med resultaten av en preoperativ avbildningsmetod (MRI-fettkvantifiering) och den nuvarande guldstandarden, leverbiopsi (dvs. histopatologisk bedömning av leverprovet).

SPECIFIKA FORSKNINGSFRÅGOR

1. Kan Raman-spektroskopi med ett bärbart fiberoptiskt system snabbt bedöma fetthalten i levern in situ i klinisk miljö? 2. Korrelerar Raman-spektra (huvudkomponentpoäng) väl med fynden av MRT-fettkvantifiering och histopatologisk bedömning av leverbiopsiprovet? STUDIEDESIGN: Denna studie är tänkt som en prospektiv valideringsstudie med ett centrum.

METODER Partiell leverresektion är kirurgiskt avlägsnande av en del av levern. De flesta partiella leverresektioner utförs för behandling av hepatiska neoplasmer. Patienter som ska genomgå en öppen partiell leverresektionsoperation på vår institution kommer att granskas med vårdkretsteamet och kontaktas för samtycke om de anses lämpliga för denna studie.

Ett formulär för informerat samtycke som godkänts av Nova Scotia Health Authority Research Ethics Board kommer att användas i samtyckesdiskussionen (som drivs av den kliniska stipendiaten eller forskningsassistenten - som båda är utredare som deltar i detta projekt) och patienterna kommer att få tid att läsa dokumentet i sin helhet innan de tillfrågas om beslut om deltagande. Patienter som ger sitt samtycke till studien kommer att tilldelas studiegruppen. Tilldelningsprocessen kommer att fortsätta tills 25 patienter ingår.

Studiedeltagare kommer att genomgå en preoperativ MRT för fettkvantifiering. De kommer att uppmanas att fasta i minst 8 timmar före MRT. Fettkvantifieringsteknik (protondensitetsfettfraktionsteknik) kommer att utföras med hjälp av IDEAL-pulssekvensen, som har godkänts av Health Canada för bedömning av leverfettsfraktion, på en 3.0-T MR-enhet (GE 750; GE Healthcare). En stipendiatutbildad bukradiolog som har erfarenhet av MR-bildtolkning kommer att mäta leverfettsfraktionen (FF) på FF-kartor, som genereras automatiskt. Den automatiskt beräknade lever-FF kommer att visas i procent på en full skala från 0-100.

Under leverresektionsproceduren kommer en del av provet som ska tas bort men inte själva lesionen att belysas av Raman-spektroskopets fiberoptiska sond. Raman-spektra som tillhandahålls och registreras i realtid (inom några sekunder) kommer sedan att analyseras (huvudkomponentanalys). Denna analys kommer att ge en PC-poäng.

Efter tillämpningen av Raman-spektroskopi kommer det operativa förfarandet att fortsätta som planerat. Histokemiska fläckar, H&E (hematoxylin-eosin) och trikrom, används rutinmässigt för tolkning av leverprover i vårt anatomiska patologiska laboratorium. Som en speciell färg kommer Oil Red O att behöva användas för att visa förekomsten och omfattningen av fettet (dvs. fettkvantifiering) i levervävnad. Eftersom det endast kan utföras på frysta sektioner kommer en fryst sektion att erhållas från den borttagna leverprovsektionen för att möjliggöra färgning av Oil Red O-specifik för att diagnostisera och kvantifiera fettdroppar. En behandlande patolog som är förblindad för MRT-fynden kommer att utvärdera dessa sektioner och bestämma graden av steatos enligt internationella standarder:

M0: ingen makrovesikulär steatos M1: mild fokal makrovesikulär steatos (<30 % hepatocyter är involverade) M2: måttlig, zonal makrovesikulär steatos (>30 och <60 % hepatocyter inblandade) M3: svår panlobulär makrovesikulär steatos (>60 % hepatocyter involverade) Korrelationsanalys kommer att utföras mellan lever-FF-procent, PC-poäng och steatosgrader för varje studiedeltagare. Studiedeltagare kommer att följas efter operationen enligt vårt standarduppföljningsprotokoll efter leverresektion utan några avvikelser från standarden för vård.

STATISTISK ANALYS För statistisk analys kommer kvantitativa data att uttryckas som medelvärden och standardavvikelser och kvalitativa data kommer att uttryckas som siffror. Linjär regression kommer att utföras mellan makrovesikulär steatosgrad och lever FF-procent och PC-poäng. Receiver operating characteristics (ROC)-kurvor kommer att genereras för PC-poäng och lever-FF-procentsatser för att identifiera deras förmåga att förutsäga graden av makrovesikulär steatos. All statistisk analys kommer att utföras med kommersiellt tillgänglig statistisk programvara (XLSTAT 2014).

Personlig hälsoinformation kommer inte att användas för genomförandet av detta projekt. Kodnummer kommer att tilldelas för varje deltagare. En databas som endast kommer att vara tillgänglig för utredarna kommer att lagras på en säker dator (kräver lösenordsinmatning) på transplantationskontoret (Queen Elizabeth II Health Sciences Centre, Victoria General Site, 4:e våningen, Dickson Building, rum 4074). Denna databas kommer att innehålla deltagarnas kodnummer och dataelement som lever-FF-procent, PC-poäng och steatosgrad.