Convalida clinica di uno spettroscopio Raman per determinare il contenuto di grasso epatico

Attualmente ci sono tre metodi principali segnalati per valutare la steatosi epatica prima del recupero del fegato da donatore deceduto: tecniche di imaging non invasive, valutazione di un campione di biopsia epatica da parte di un patologo esperto e valutazione da parte del chirurgo del trapianto.

Le tecniche di imaging attualmente in uso includono l'ecografia (USG), la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI). Sebbene abbia un livello di sensibilità accettabile, USG non fornisce informazioni quantitative riproducibili. Può essere utilizzato nella maggior parte dei centri ma dipende dall'operatore. Allo stesso modo, le prestazioni diagnostiche della TAC non potenziata per l'accurata quantificazione della steatosi sono inaffidabili. La risonanza magnetica è altamente sensibile e specifica nella diagnosi della steatosi epatica ed è stato riportato che la quantificazione del grasso mediante una risonanza magnetica da 3,0 T può fornire una sensibilità sufficiente per rilevare e quantificare la steatosi nei candidati donatori di fegato vivi. Tuttavia, questa complessa tecnologia ne limita l'uso nell'approvvigionamento di organi di routine.

La valutazione microscopica di un campione di biopsia epatica da parte di un patologo esperto è il gold standard per la valutazione della steatosi. La presenza e il tipo di steatosi possono essere determinati mediante valutazione microscopica. Il grado di steatosi può essere determinato secondo gli standard internazionali.

Nonostante siano il gold standard, le biopsie vengono registrate solo per il 23% dei fegati trapiantati negli Stati Uniti. Poiché un patologo non è sempre disponibile al momento dell'acquisizione, molti centri si affidano principalmente alla valutazione della steatosi e della qualità dell'organo da parte del chirurgo responsabile dell'acquisizione (ad es. chirurgo dei trapianti). Durante questa valutazione il fegato del donatore viene valutato in base a criteri di consistenza parenchimale come il grado di giallo (normale, lieve, moderato, grave) e il grado di compattezza (morbido, normale; lieve, moderato, grave). Tuttavia, gli studi che hanno esaminato l'accuratezza con cui un chirurgo dei trapianti potrebbe prevedere la steatosi epatica hanno concluso che queste valutazioni potrebbero essere significativamente fuorvianti anche in mani esperte.

Poiché tutti e tre questi metodi hanno i loro limiti, è necessaria una tecnica comoda e semplice per valutare meglio il contenuto di grasso epatico prima del trapianto. La spettroscopia Raman è una tecnica di diffusione della luce anelastica sensibile alle vibrazioni molecolari, la cui simmetria e frequenze sono uniche per il tipo di atomi e la loro disposizione spaziale. La sensibilità a queste proprietà è alla base della sua capacità di fornire un'impronta digitale spettrale delle molecole nella regione illuminata. È stato utilizzato per rilevare aminoacidi, basi nucleotidiche, acidi grassi, saccaridi, metaboliti primari e altri costituenti che formano le proteine, i carboidrati, i grassi e il DNA/RNA dei tessuti biologici. È una tecnologia interessante per la bioanalisi perché non è necessaria alcuna preparazione del campione.

La spettroscopia Raman è attualmente in fase di studio per l'uso in contesti clinici e viene eseguita principalmente per scopi diagnostici. Attualmente è approvato per l'uso in Canada per la diagnosi del cancro della pelle.

Esistono diversi sistemi di spettroscopia Raman. Abbiamo recentemente progettato un sistema di spettroscopia Raman ad alto rendimento che è più piccolo degli altri, portatile e robusto. Consente di eseguire scansioni in situ del tessuto con pochissima esperienza richiesta all'operatore. Questo sistema utilizza la lunghezza d'onda di eccitazione del vicino infrarosso (NIR) per migliorare la profondità di penetrazione del laser riducendo al contempo la possibilità di danni ai tessuti. Fornisce informazioni sotto forma di spettri Raman, la cui analisi fornisce un punteggio di componente principale (PC).

Questo sistema appositamente progettato potrebbe quantificare con precisione la steatosi nei topi e nei fegati di ratto. I punteggi PC hanno mostrato una correlazione significativa con i risultati dell'esame istopatologico. Poiché la steatosi nel tessuto epatico umano mostra cambiamenti simili al lobo epatico sinistro di topi e ratti, abbiamo concluso che questa tecnica potrebbe essere applicata al campo del trapianto. La convalida clinica e la successiva adozione di questa tecnica possono fornire agli specialisti dei trapianti uno strumento prezioso per ottenere informazioni in tempo reale sulla gravità della steatosi epatica per valutare la probabilità di un esito positivo e ridurre i tassi di scarto involontario di organi.

OBIETTIVO Lo scopo di questo studio è convalidare la spettroscopia Raman (mediante il nostro sistema Raman in fibra ottica ad alto rendimento appositamente progettato) in un contesto clinico nella valutazione del contenuto di grasso epatico. Gli spettri Raman in vivo (punteggi PC) saranno confrontati con i risultati di un metodo di imaging preoperatorio (quantificazione del grasso MRI) e l'attuale gold standard, la biopsia epatica (es. valutazione istopatologica del campione di fegato).

DOMANDE DI RICERCA SPECIFICHE

1. La spettroscopia Raman che utilizza un sistema a fibre ottiche portatile può valutare rapidamente il contenuto di grasso del fegato in situ in ambito clinico? 2. Gli spettri Raman (punteggi dei componenti principali) si correlano bene con i risultati della quantificazione del grasso MRI e la valutazione istopatologica del campione bioptico epatico? DISEGNO DELLO STUDIO: Questo studio è concepito come uno studio di convalida prospettico a centro singolo.

METODI La resezione parziale del fegato è l'asportazione chirurgica di una porzione del fegato. La maggior parte delle resezioni epatiche parziali viene eseguita per il trattamento delle neoplasie epatiche. I pazienti che subiranno un intervento chirurgico di resezione epatica parziale aperta nel nostro istituto saranno esaminati con il circolo del team di assistenza e contattati per il consenso se ritenuti idonei per questo studio.

Nella discussione sul consenso verrà utilizzato un modulo di consenso informato approvato dal comitato etico della ricerca della Nova Scotia Health Authority (gestito dal borsista clinico o dal ricercatore associato, entrambi ricercatori che partecipano a questo progetto) e ai pazienti verrà concesso il tempo di leggere il documento per intero prima che venga richiesta una decisione sulla partecipazione. I pazienti che danno il loro consenso per lo studio saranno assegnati al gruppo di studio. Il processo di assegnazione continuerà fino a quando non saranno inclusi 25 pazienti.

I partecipanti allo studio saranno sottoposti a una risonanza magnetica preoperatoria per la quantificazione del grasso. Verrà chiesto loro di digiunare per almeno 8 ore prima della risonanza magnetica. La tecnica di quantificazione del grasso (tecnica della frazione di grasso della densità protonica) verrà eseguita utilizzando la sequenza di impulsi IDEAL, che è stata approvata da Health Canada per la valutazione della frazione di grasso epatico, su un'unità 3.0-T MR (GE 750; GE Healthcare). Un radiologo addominale formato da una borsa di studio esperto nell'interpretazione di immagini RM misurerà la frazione di grasso epatico (FF) sulle mappe FF, che verranno generate automaticamente. La FF epatica calcolata automaticamente verrà visualizzata come percentuale su una scala completa di 0-100.

Durante la procedura di resezione epatica una regione del campione che deve essere rimossa ma non la lesione effettiva verrà illuminata dalla sonda a fibre ottiche dello spettroscopio Raman. Gli spettri Raman forniti e registrati in tempo reale (entro pochi secondi) saranno successivamente analizzati (analisi delle componenti principali). Questa analisi fornirà un punteggio PC.

Dopo l'applicazione della spettroscopia Raman, la procedura operativa proseguirà come previsto. Le colorazioni istochimiche, H&E (ematossilina-eosina) e tricromica, vengono abitualmente utilizzate per l'interpretazione dei campioni di fegato nel nostro laboratorio di anatomia patologica. Come colorante speciale sarà necessario utilizzare Oil Red O per dimostrare la presenza e l'entità del grasso (ad es. quantificazione del grasso) nel tessuto epatico. Poiché può essere eseguito solo su sezioni congelate, dalla sezione del campione di fegato rimosso verrà ottenuta una sezione congelata per consentire la colorazione Oil Red O, specifica per la diagnosi e la quantificazione delle goccioline di grasso. Un patologo presente che non vede i risultati della risonanza magnetica valuterà queste sezioni e determinerà il grado di steatosi secondo gli standard internazionali:

M0: nessuna steatosi macrovescicolare M1: steatosi macrovescicolare focale lieve (<30% di epatociti coinvolti) M2: moderata steatosi macrovescicolare zonale (>30 e <60% di epatociti coinvolti) M3: grave steatosi macrovescicolare panlobulare (>60% di epatociti coinvolti) Verrà eseguita un'analisi di correlazione tra percentuali di FF epatico, punteggi PC e gradi di steatosi per ciascun partecipante allo studio. I partecipanti allo studio saranno seguiti dopo l'intervento chirurgico secondo il nostro protocollo standard di follow-up post-resezione epatica senza alcuna deviazione dallo standard di cura.

ANALISI STATISTICA Per l'analisi statistica, i dati quantitativi saranno espressi come medie e deviazioni standard ei dati qualitativi saranno espressi come numeri. Verrà eseguita una regressione lineare tra il grado di steatosi macrovescicolare e le percentuali di FF epatico e i punteggi PC. Le curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) saranno generate per i punteggi PC e le percentuali FF epatiche per identificare la loro capacità di prevedere il grado di steatosi macrovescicolare. Tutte le analisi statistiche saranno eseguite con un software statistico disponibile in commercio (XLSTAT 2014).

Le informazioni sulla salute personale non saranno utilizzate per lo svolgimento di questo progetto. Ad ogni partecipante verranno assegnati numeri di codice. Un database che sarà accessibile solo agli investigatori sarà archiviato in un computer protetto (che richiede l'inserimento di una password) nell'ufficio trapianti (Queen Elizabeth II Health Sciences Centre, Victoria General Site, 4th floor, Dickson Building, Room 4074). Questo database includerà i numeri di codice dei partecipanti e gli elementi di dati come la percentuale di FF epatico, il punteggio PC e il grado di steatosi.