Klinický význam jaterních a cirkulujících mikroRNA miR-221 a miR-222 u hepatocelulárního karcinomu

Pozadí a zdůvodnění Hepatocelulární karcinom (HCC) je šestým nejčastějším zhoubným nádorem na světě a je třetí příčinou úmrtnosti související s rakovinou.

Chirurgická resekce zůstává nejlepší léčebnou možností pro pacienty s klinickým onemocněním barcelonského karcinomu jater (BCLC) stadia A a prokázala výhody i v pokročilejším stadiu B s multifokálním onemocněním nebo omezenou vaskulární invazí.

Navzdory kurativní léčbě, která nabízí pětiletou míru přežití 50–70 %, je míra recidivy po 5 letech po operaci až 70 %. Proto je zapotřebí více úsilí k identifikaci prognostických faktorů pro recidivu a přežití.

MikroRNA jsou třídou malých nekódujících molekul RNA, které působí jako klíčové regulátory buněčné proliferace, diferenciace, apoptózy a embryonálního vývoje a jemně dolaďují genovou expresi na post-transkripční úrovni. Působí jako onkogeny nebo nádorové supresory v závislosti na cílových genech. U HCC byla hlášena upregulace nebo downregulace několika shluků mikroRNA s následnou aktivací molekulárních sítí, jako je b-catenin, Ras, TGF-b, JAK/STAT, a vytvoření vysoce kontrolovaného mechanismu zpětné vazby.

Jejich zapojení do karcinogeneze představuje důležitou oblast výzkumu pro rozvoj jejich klinických aplikací: diagnostika, monitorování a terapeutika. Profily mikroRNA mohou rozlišovat mezi normální a rakovinnou tkání, identifikovat tkáň původu a také rozlišovat různé podtypy nebo specifické onkogenní abnormality. Vzorce chybné exprese mikroRNA jsou skutečně přesnější při identifikaci původu nádorů, které je jinak obtížné určit, což naznačuje, že nádory si jasněji zachovávají jedinečný profil tkáňové exprese mikroRNA.

MikroRNA by také mohly být užitečné jako biomarkery časné diagnózy pro sledování pacienta.

V tumorigenezi jater nebyla úloha miR-221 a miR-222 zcela objasněna. Předchozí studie ukázaly, že miR-221 byl upregulován v 83 % nádorových vzorků HCC ve srovnání s odpovídající cirhotickou tkání.

U pacientů s HCC byla zjištěna zvýšená exprese miR-221 v séru ve srovnání se zdravými normálními kontrolami, což bylo spojeno s přítomností dalších špatných prognostických faktorů a s horšími výsledky po resekci jater.

Extrakce mikroRNA ze vzorků jater je limitována schopností resekce nádoru nebo možností provést jaterní biopsii u každého pacienta. Naopak, vzorek krve lze snadno odebrat a uložit pro analýzu. V současné době nebyla jasně stanovena korelace mezi expresí miR-221 a miR-222 v jaterní tkáni (nádorové a nenádorové) a hladinami miR-221 a miR-222 v oběhu.

Potvrzení této korelace by umožnilo identifikovat hranici cirkulujících hladin, která by mohla být použita jako náhradní marker pro zahrnutí pacientů s HCC do studií fáze 3 bez potřeby jaterní biopsie, která je často kontraindikována z klinických důvodů a podle pokyny.

Toto je pilotní studie k vyhodnocení korelace mezi nadměrnou expresí miR-221 a miR-222 ve spárovaných nádorových/nenádorových jaterních tkáních a krevních vzorcích u pacientů s HCC a k identifikaci hraniční hodnoty pro cirkulující hladiny, které lze použít jako náhradní marker. v klinických studiích.

Tato studie si proto klade za cíl vyhodnotit, zda exprese miR-221 a miR-222 v krvi koreluje s tkáňovou expresí a zda by cirkulující hladiny mohly být použity jako náhrada nadměrné exprese v nádorové jaterní tkáni.

Pokud by toto hodnocení prokázalo silnou korelaci a spolehlivost cirkulujících miRNA při diagnóze a sledování HCC, budoucí klinické studie zaměřené na tyto miRNA a jejich související dráhy by mohly mít prospěch z toho, že by to bylo přijato jako běžná praxe namísto potřeby hodnocení tkáňových hladin z jaterní biopsie.

Zkouška bude provedena v souladu se zásadami Helsinské deklarace, zásadami GCP a všemi (pokud existují) platnými regulačními požadavky jsou zásadní.

NHS Grampian Biorepository poskytne anonymizované vzorky, které budou použity pro tuto studii. NHS Grampian Biorepository již má etické schválení pro tyto typy studií. Bude požadováno schválení výzkumu a vývoje.

Metody Vzorky krve od pacientů s HCC a od zdravých kontrol stejného věku, uložené v National bio-repository Scotland, budou testovány na expresi miR-221 a miR-222 v reálném čase pomocí reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce (RT -qPCR). Podobně budou hladiny miR-221 a miR-222 hodnoceny u pacientů s HCC v páru s rakovinou a zdravou jaterní tkání.

Analýza vzorků bude probíhat v laboratoři Institutu pro výzkum zdraví a pohody na Robert Gordon University (RGU) - Aberdeen.

Výsledky analýzy vzorků a kvantifikace mikroRNA pomocí RT-qPCR provede hlavní řešitel spolu s výzkumným týmem v laboratorních zařízeních.

Vzorky budou analyzovány pro posouzení nadměrné exprese miR-221 a miR-222 mezi nádorovou a nenádorovou jaterní tkání a pro posouzení korelace mezi tímto a cirkulujícími miR-221 a miR-222. Hladiny v oběhu budou porovnány s výsledky ze zdravých kontrol stejného věku.

Správcem dat generovaných studií bude hlavní řešitel.

Vzorky budou uloženy v laboratorních zařízeních RGU a přístup k nim bude mít pouze hlavní řešitel a výzkumný tým.

Data vygenerovaná studií budou shromážděna v tabulkovém procesoru, který bude vytvořen na míru a bude uložen na intranetu s přístupem omezeným pouze na CI a výzkumný tým.

Anonymizovaná data o počítačových souborech budou uložena v databázích chráněných heslem, do kterých mají přístup pouze řešitelé studie.

Všechny písemné soubory budou uloženy v uzamčených plnicích skříních v zabezpečeném obchodě na Univerzitě Roberta Gordona s výjimkou souhlasů, které jsou uloženy v NHS Grampian Biorepository.

Budou dodržovány postupy monitorování University of Aberdeen a NHS Grampian.

Na konci výzkumu budou vzorky uloženy výzkumným týmem až do etického schválení pro použití v jiném projektu, zatímco data vygenerovaná studií budou uložena v heslem chráněných databázích přístupných pouze řešitelům studie.

Proces souhlasu NHS Grampian Biorepository si vyžádá informovaný souhlas pacientů s odběrem vzorků tkáně a krve prostřednictvím specializované výzkumné sestry a použitím informačního listu pacienta a formuláře souhlasu, které jsou součástí dokumentace NHS Grampian Biorepository.

Souhlas bude získán pro všechny vzorky použité v této studii v souladu s procesem souhlasu Biorepository.

Zkušební vývojový diagram

• Pět zmrazených párových jaterních nádorových a nenádorových tkání a pět zmrazených vzorků plazmy získaných od pacientů s HCC a uložených v National Bio-Repository Scotland (HCC Group, HCC). Bude vybráno pět dobrovolných zdravých kontrol odpovídajících věku, aby bylo možné uvést do vztahu expresi cirkulujících miRNA (Plasma Control Group, PCG).
• Spárované zmrazené vzorky tkáně HCC a jejich přilehlá nerakovinná normální játra budou odebrány do zkumavek pro stabilizaci RNA a uloženy při -80 °C do další analýzy a extrakce miRNA podle protokolu. Průměrná velikost vzorku bude 2 x 10 mm v průměru.
• Budou odebrány vzorky krve odebrané z HCC Group a PCG (8-10 ml, do zkumavek pro odběr krve BD Vacutainer K3-EDTA). Všechny vzorky budou odeslány do Bio-Repository pro další zpracování a poté analýzu a extrakci miRNA podle protokolu.
• Výsledky extrakce miRNA z párových HCC/nerakovinných tkání budou porovnány a z plazmy skupiny HCC budou porovnány s odpovídající plazmou kontrol (skupina PCG).