Significato clinico dei microRNA epatici e circolanti miR-221 e miR-222 nel carcinoma epatocellulare

Contesto e fondamento logico Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il sesto tumore più diffuso al mondo ed è la terza causa di mortalità correlata al cancro.

La resezione chirurgica rimane la migliore opzione di trattamento curativo per i pazienti con malattia clinica in stadio A della Barcelona-Clinic Liver Cancer (BCLC) e ha mostrato benefici anche nello stadio B più avanzato con malattia multifocale o limitata invasione vascolare.

Nonostante i trattamenti curativi offrano un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 50-70%, i tassi di recidiva a 5 anni dall'intervento raggiungono il 70%. Pertanto, sono necessari ulteriori sforzi per identificare i fattori prognostici di recidiva e sopravvivenza.

I microRNA sono una classe di piccole molecole di RNA non codificanti, che agiscono come regolatori chiave della proliferazione cellulare, differenziazione, apoptosi e sviluppo embrionale, regolando finemente l'espressione genica a livello post-trascrizionale. Agiscono come oncogeni o soppressori tumorali a seconda dei geni bersaglio. Nell'HCC, è stata segnalata la sovraregolazione o la sottoregolazione di alcuni cluster di microRNA, con successiva attivazione di reti molecolari come b-catenina, Ras, TGF-b, JAK/STAT e creazione di un meccanismo di feedback altamente controllato.

Il loro coinvolgimento nella carcinogenesi rappresenta un'importante area di indagine per lo sviluppo delle loro applicazioni cliniche: diagnostica, monitoraggio e terapeutica. I profili di microRNA possono distinguere tra tessuto normale e canceroso, identificare il tessuto di origine e anche discriminare diversi sottotipi o specifiche anomalie oncogeniche. In effetti, i modelli di espressione errata del microRNA sono più accurati nell'identificare l'origine dei tumori che sono altrimenti difficili da determinare, suggerendo che i tumori mantengono più chiaramente un profilo di espressione del microRNA tissutale unico.

I microRNA potrebbero anche essere utili come biomarcatori di diagnosi precoce per il follow-up dei pazienti.

Nella tumorigenesi epatica, il ruolo di miR-221 e miR-222 non è stato completamente chiarito. Precedenti studi hanno mostrato che il miR-221 era sovraregolato nell'83% dei campioni tumorali di HCC rispetto al tessuto cirrotico corrispondente.

Nei pazienti con HCC è stata riscontrata una maggiore espressione di miR-221 sierico rispetto ai controlli normali sani, che era associata alla presenza di altri fattori prognostici sfavorevoli e con esiti peggiori dopo resezione epatica.

L'estrazione di microRNA da campioni di fegato è limitata dalla capacità di resecare il tumore o dalla possibilità di eseguire una biopsia epatica in ciascun paziente. Al contrario, un campione di sangue è facile da raccogliere e conservare per l'analisi. Al momento, non è stata chiaramente stabilita una correlazione tra l'espressione di miR-221 e miR-222 nel tessuto epatico (tumorale e non tumorale) ei livelli circolanti di miR-221 e miR-222.

La conferma di questa correlazione, permetterebbe di identificare un cut-off dei livelli circolanti che potrebbe essere utilizzato come marcatore surrogato per includere i pazienti con HCC negli studi di fase 3 senza la necessità di una biopsia epatica, che è spesso controindicata per ragioni cliniche e secondo linee guida.

Questo è uno studio pilota per valutare la correlazione tra la sovraespressione di miR-221 e miR-222 in tessuto epatico tumorale/non tumorale accoppiato e campioni di sangue in pazienti con HCC e per identificare un limite per i livelli circolanti da utilizzare come marcatore surrogato negli studi clinici.

Questo studio si propone quindi di valutare se l'espressione di miR-221 e miR-222 nel sangue sia correlata con l'espressione tissutale e se i livelli circolanti possano essere utilizzati come surrogato della sovraespressione nel tessuto epatico tumorale.

Se questa valutazione dovesse mostrare una forte correlazione e affidabilità dei miRNA circolanti, nella diagnosi e nel follow-up dell'HCC, futuri studi clinici mirati a questi miRNA e ai loro percorsi correlati potrebbero trarre vantaggio dall'adozione di questa pratica come pratica convenzionale invece della necessità di valutare i livelli tissutali da biopsie epatiche.

La sperimentazione sarà condotta in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki, i principi della GCP e tutti i requisiti normativi applicabili (se presenti) sono essenziali.

NHS Grampian Biorepository fornirà i campioni anonimizzati da utilizzare per questo studio. NHS Grampian Biorepository dispone già dell'approvazione etica per questi tipi di studi. Verrà richiesta l'approvazione di ricerca e sviluppo.

Metodi I campioni di sangue di pazienti con HCC e di controlli sani di pari età, conservati nel National bio-repository Scotland, saranno testati per l'espressione circolante di miR-221 e miR-222 mediante Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT -qPCR). Allo stesso modo, i livelli di miR-221 e miR-222 saranno valutati in pazienti affetti da cancro associato e tessuto epatico sano con HCC.

L'analisi del campione si svolgerà nel laboratorio di ricerca dell'Istituto per la salute e il benessere presso la Robert Gordon University (RGU) - Aberdeen.

I risultati dell'analisi dei campioni e la quantificazione dei microRNA tramite RT-qPCR saranno eseguiti dal ricercatore capo insieme al gruppo di ricerca nelle strutture del laboratorio.

I campioni saranno analizzati per valutare la sovraespressione di miR-221 e miR-222 tra tessuto epatico tumorale e non tumorale e per valutare la correlazione tra questa e la circolazione di miR-221 e miR-222. I livelli circolanti saranno confrontati con i risultati di controlli sani di pari età.

Il custode dei dati generati dallo studio sarà il capo investigatore.

I campioni saranno conservati nelle strutture di laboratorio dell'RGU e vi avranno accesso solo il ricercatore capo e il gruppo di ricerca.

I dati generati dallo studio saranno raccolti in un foglio di calcolo che sarà su misura e tenuto su intranet con accesso limitato solo all'IC e al gruppo di ricerca.

I dati resi anonimi sui file del computer saranno archiviati su database protetti da password accessibili solo ai ricercatori dello studio.

Tutti i file scritti saranno archiviati in armadi di riempimento chiusi a chiave all'interno di un archivio sicuro presso la Robert Gordon University, ad eccezione dei consensi che sono archiviati dal NHS Grampian Biorepository.

Saranno seguite le procedure di monitoraggio dell'Università di Aberdeen e del NHS Grampian.

Al termine della ricerca i campioni verranno archiviati dal gruppo di ricerca in attesa dell'approvazione etica per l'utilizzo in un altro progetto, mentre i dati generati dallo studio verranno archiviati su database protetti da password accessibili solo ai ricercatori dello studio.

Processo di consenso NHS Grampian Biorepository richiede il consenso informato da parte dei pazienti per la raccolta di campioni di tessuto e sangue attraverso un'infermiera di ricerca dedicata e l'uso di un foglio informativo per il paziente e un modulo di consenso che fanno parte della documentazione di NHS Grampian Biorepository.

Verrà ottenuto un consenso per tutti i campioni utilizzati in questo studio secondo il processo di consenso del Biorepository.

Diagramma di flusso di prova

• Cinque campioni di tessuto epatico tumorale e non tumorale accoppiati congelati e cinque campioni di plasma congelato ottenuti da pazienti con HCC e conservati nel National Bio-Repository Scotland (HCC Group, HCC). Verranno reclutati cinque controlli sani volontari della stessa età per mettere in relazione l'espressione dei miRNA circolanti (Plasma Control Group, PCG).
• Campioni di tessuto HCC congelati accoppiati e il loro fegato normale non canceroso adiacente saranno raccolti in provette di stabilizzazione dell'RNA e conservati a -80 ° C fino a ulteriori analisi ed estrazione di miRNA come da protocollo. La dimensione media del campione sarà di 2 x 10 mm di diametro.
• Saranno raccolti campioni di sangue prelevati sia dal gruppo HCC che dal PCG (8-10 ml, in provette per la raccolta del sangue BD Vacutainer K3-EDTA). Tutti i campioni verranno inviati al Bio-Repository per l'ulteriore elaborazione e quindi l'analisi e l'estrazione dei miRNA come da protocollo.
• I risultati dell'estrazione di miRNA da tessuti accoppiati HCC/non cancerosi saranno confrontati e dal plasma del gruppo HCC saranno confrontati con il plasma corrispondente dei controlli (gruppo PCG).