Importancia clínica de los microARN hepáticos y circulantes miR-221 y miR-222 en el carcinoma hepatocelular

Antecedentes y justificación El carcinoma hepatocelular (HCC) es el sexto cáncer más prevalente en todo el mundo y es la tercera causa de mortalidad relacionada con el cáncer.

La resección quirúrgica sigue siendo la mejor opción de tratamiento curativo para pacientes con enfermedad clínica en estadio A de Barcelona-Clinic Liver Cancer (BCLC) y ha demostrado beneficios incluso en el estadio B más avanzado con enfermedad multifocal o invasión vascular limitada.

A pesar de que los tratamientos curativos ofrecen una tasa de supervivencia a 5 años del 50-70 %, las tasas de recurrencia a los 5 años después de la cirugía llegan al 70 %. Por lo tanto, se necesitan más esfuerzos para identificar los factores pronósticos de recurrencia y supervivencia.

Los microARN son una clase de pequeñas moléculas de ARN no codificantes que actúan como reguladores clave de la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y el desarrollo embrionario, ajustando con precisión la expresión génica a nivel postranscripcional. Actúan como oncogenes o supresores de tumores según los genes diana. En HCC, se ha informado la regulación positiva o negativa de algunos grupos de microARN, con la posterior activación de redes moleculares como b-catenina, Ras, TGF-b, JAK/STAT y la creación de un mecanismo de retroalimentación altamente controlado.

Su implicación en la carcinogénesis representa una importante área de investigación para el desarrollo de sus aplicaciones clínicas: diagnóstico, seguimiento y terapéutica. Los perfiles de microARN pueden distinguir entre tejido normal y canceroso, identificar el tejido de origen y también discriminar diferentes subtipos o anomalías oncogénicas específicas. De hecho, los patrones de expresión errónea de microARN son más precisos para identificar el origen de los tumores que, de otro modo, serían difíciles de determinar, lo que sugiere que los tumores mantienen más claramente un perfil único de expresión de microARN en tejido.

Los microARN también podrían ser útiles como biomarcadores de diagnóstico precoz para el seguimiento de los pacientes.

En la tumorigénesis hepática, el papel de miR-221 y miR-222 no se ha dilucidado por completo. Estudios previos mostraron que miR-221 estaba regulado al alza en el 83 % de las muestras tumorales de CHC en comparación con tejido cirrótico compatible.

Se encontró una mayor expresión de miR-221 sérico en pacientes con HCC en comparación con controles normales sanos, lo que se asoció con la presencia de otros factores de mal pronóstico y con peores resultados después de la resección hepática.

La extracción de microRNAs de muestras de hígado está limitada por la capacidad de resecar el tumor o la posibilidad de realizar una biopsia de hígado en cada paciente. Por el contrario, una muestra de sangre es fácil de recoger y almacenar para su análisis. En la actualidad, no se ha establecido claramente una correlación entre la expresión de miR-221 y miR-222 en el tejido hepático (tumoral y no tumoral) y los niveles circulantes de miR-221 y miR-222.

La confirmación de esta correlación permitiría identificar un punto de corte de los niveles circulantes que podría usarse como marcador sustituto para incluir pacientes con CHC en ensayos de fase 3 sin necesidad de una biopsia hepática, que a menudo está contraindicada por razones clínicas y de acuerdo con pautas.

Este es un estudio piloto para evaluar la correlación entre la sobreexpresión de miR-221 y miR-222 en muestras de sangre y tejido hepático tumoral/no tumoral emparejado en pacientes con HCC y para identificar un punto de corte para los niveles circulantes para usarlo como marcador sustituto. en ensayos clínicos.

Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo evaluar si la expresión de miR-221 y miR-222 en la sangre se correlaciona con la expresión tisular y si los niveles circulantes podrían usarse como un sustituto de la sobreexpresión en el tejido hepático tumoral.

Si esta evaluación muestra una fuerte correlación y confiabilidad de los miARN circulantes, en el diagnóstico y seguimiento del CHC, los futuros ensayos clínicos dirigidos a estos miARN y sus vías relacionadas podrían beneficiarse de que se adopte como práctica convencional en lugar de la necesidad de evaluar los niveles tisulares de biopsias de hígado.

El ensayo se llevará a cabo de conformidad con los principios de la Declaración de Helsinki, los principios de BPC y todos los requisitos reglamentarios aplicables (si los hay) son esenciales.

NHS Grampian Biorepository proporcionará las muestras anónimas que se utilizarán para este estudio. NHS Grampian Biorepository ya cuenta con la aprobación ética para este tipo de estudios. Se buscará la aprobación de Investigación y Desarrollo.

Métodos Las muestras de sangre de pacientes con CHC y de controles sanos de la misma edad, almacenadas en el biorrepositorio nacional de Escocia, se analizarán para determinar la expresión de miR-221 y miR-222 circulantes por medio de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT). -qPCR). De manera similar, los niveles de miR-221 y miR-222 se evaluarán en pacientes con cáncer emparejado y tejido hepático sano con CHC.

El análisis de muestras se llevará a cabo en el laboratorio del Instituto para la Investigación de la Salud y el Bienestar de la Universidad Robert Gordon (RGU) - Aberdeen.

Los resultados del análisis de las muestras y la cuantificación de microRNAs mediante RT-qPCR serán realizados por el investigador principal junto con el equipo de investigación en las instalaciones del laboratorio.

Las muestras se analizarán para evaluar la sobreexpresión de miR-221 y miR-222 entre tejido hepático tumoral y no tumoral y para evaluar la correlación entre esto y miR-221 y miR-222 circulantes. Los niveles circulantes se compararán con los resultados de controles sanos de la misma edad.

El custodio de los datos generados por el estudio será el Investigador Jefe.

Las muestras se almacenarán en las instalaciones del laboratorio de la RGU y solo tendrán acceso el investigador principal y el equipo de investigación.

Los datos generados por el estudio se recopilarán en una hoja de cálculo que se hará a la medida y se mantendrá en la intranet con acceso restringido solo para el IC y el equipo de investigación.

Los datos anónimos en los archivos informáticos se almacenarán en bases de datos protegidas con contraseña a las que solo podrán acceder los investigadores del estudio.

Todos los archivos escritos se almacenarán en gabinetes de llenado cerrados dentro de un almacén seguro en la Universidad Robert Gordon, con la excepción de los consentimientos que se almacenan en el Biorepositorio NHS Grampian.

Se seguirán los procedimientos de monitoreo de la Universidad de Aberdeen y NHS Grampian.

Al final de la investigación, el equipo de investigación almacenará las muestras en espera de la aprobación ética para su uso en otro proyecto, mientras que los datos generados por el estudio se almacenarán en bases de datos protegidas con contraseña a las que solo podrán acceder los investigadores del estudio.

Proceso de consentimiento NHS Grampian Biorepository busca el consentimiento informado de los pacientes para la recolección de muestras de tejido y sangre a través de una enfermera de investigación dedicada y el uso de una hoja de información del paciente y un formulario de consentimiento que forman parte de la documentación del NHS Grampian Biorepository.

Se obtendrá un consentimiento para todas las muestras utilizadas en este estudio de acuerdo con el proceso de consentimiento del Biorepositorio.

Diagrama de flujo de prueba

• Cinco muestras de tejido hepático tumoral y no tumoral emparejado congelado y cinco muestras de plasma congelado obtenidas de pacientes con HCC y almacenadas en el Bio-Repositorio Nacional de Escocia (HCC Group, HCC). Se reclutarán cinco controles sanos voluntarios de la misma edad para relacionar la expresión de los miRNA circulantes (Plasma Control Group, PCG).
• Las muestras de tejido HCC congeladas emparejadas y su hígado normal no canceroso adyacente se recolectarán en tubos de estabilización de ARN y se almacenarán a -80 °C hasta su posterior análisis y extracción de miARN según el protocolo. El tamaño medio de la muestra será de 2 por 10 mm de diámetro.
• Se recolectarán muestras de sangre recolectadas tanto del grupo HCC como del PCG (8-10 ml, en tubos de recolección de sangre BD Vacutainer K3-EDTA). Todas las muestras se enviarán a Bio-Repository para su posterior procesamiento y luego análisis y extracción de miRNAs según el protocolo.
• Se compararán los resultados de la extracción de miARN de HCC/tejidos no cancerosos emparejados y del plasma del grupo HCC se comparará con el plasma emparejado de los controles (grupo PCG).