Klinisk betydning av hepatiske og sirkulerende mikroRNA miR-221 og miR-222 i hepatocellulært karsinom

Bakgrunn og begrunnelse Hepatocellulært karsinom (HCC) er den sjette mest utbredte kreftformen på verdensbasis, og er den tredje årsaken til kreftrelatert dødelighet.

Kirurgisk reseksjon er fortsatt det beste kurative behandlingsalternativet for pasienter med klinisk Barcelona-Clinic Liver Cancer (BCLC) stadium A sykdom, og det har vist fordeler selv i mer avansert stadium B med multifokal sykdom eller begrenset vaskulær invasjon.

Til tross for kurative behandlinger som tilbyr en 5-års overlevelsesrate på 50-70 %, er tilbakefallsraten 5 år etter operasjonen så høy som 70 %. Derfor er det nødvendig med mer innsats for å identifisere prognostiske faktorer for tilbakefall og overlevelse.

MikroRNA er en klasse av små ikke-kodende RNA-molekyler, som fungerer som nøkkelregulatorer for celleproliferasjon, differensiering, apoptose og embryonal utvikling, og finjusterer genuttrykk på post-transkripsjonelt nivå. De fungerer som onkogener eller tumorsuppressorer avhengig av målgenene. I HCC har det blitt rapportert oppregulering eller nedregulering av noen få klynge mikroRNA, med en påfølgende aktivering av molekylære nettverk som b-catenin, Ras, TGF-b, JAK/STAT og opprettelse av en svært kontrollert tilbakemeldingsmekanisme.

Deres involvering i karsinogenese representerer et viktig undersøkelsesområde for utviklingen av deres kliniske applikasjoner: diagnostikk, overvåking og terapi. MicroRNA-profiler kan skille mellom normalt og kreftvev, identifisere opprinnelsesvev og også diskriminere forskjellige undertyper eller spesifikke onkogene abnormiteter. Faktisk er mikroRNA-feiluttrykksmønstre mer nøyaktige når det gjelder å identifisere opprinnelsen til svulster som ellers er vanskelige å bestemme, noe som tyder på at svulster tydeligere opprettholder en unik vevsmikroRNA-ekspresjonsprofil.

MikroRNA kan også være nyttige som biomarkører for tidlig diagnose for pasientoppfølging.

I levertumorgenese er rollen til miR-221 og miR-222 ikke fullstendig belyst. Tidligere studier viste at miR-221 ble oppregulert i 83 % av HCC-tumorprøver sammenlignet med matchet skrumplever.

Økt ekspresjon av serum miR-221 ble funnet hos HCC-pasienter sammenlignet med friske normale kontroller, som var assosiert med tilstedeværelsen av andre dårlige prognostiske faktorer og med dårligere utfall etter leverreseksjon.

Ekstraksjonen av mikroRNA fra leverprøver er begrenset av evnen til å reseksjonere svulsten eller muligheten til å utføre en leverbiopsi hos hver pasient. Tvert imot er en blodprøve enkel å samle inn og lagre for analyse. For tiden er det ikke klart etablert en korrelasjon mellom uttrykket av miR-221 og miR-222 i levervevet (tumoralt og ikke-tumoralt) og sirkulerende miR-221 og miR-222 nivåer.

Bekreftelsen av denne korrelasjonen, ville tillate å identifisere et grensesnitt for sirkulerende nivåer som kan brukes som en surrogatmarkør for å inkludere HCC-pasienter i fase 3-studier uten behov for en leverbiopsi, som ofte er kontraindisert av kliniske årsaker og iht. retningslinjer.

Dette er en pilotstudie for å evaluere korrelasjonen mellom overekspresjonen av miR-221 og miR-222 i sammenkoblede tumorale/ikke-tumorale levervev og blodprøver hos pasienter med HCC og for å identifisere en grense for de sirkulerende nivåene som kan brukes som surrogatmarkør i kliniske studier.

Denne studien tar derfor sikte på å evaluere om miR-221 og miR-222 uttrykk i blodet korrelerer med vevsuttrykk og om de sirkulerende nivåene kan brukes som et surrogat for overekspresjon i tumoral levervev.

Skulle denne evalueringen vise en sterk korrelasjon og pålitelighet av sirkulerende miRNA, i diagnostisering og oppfølging av HCC, kan fremtidige kliniske studier rettet mot disse miRNAene og deres relaterte veier ha nytte av at dette blir tatt i bruk som konvensjonell praksis i stedet for behovet for å vurdere vevsnivåer fra leverbiopsier.

Forsøket vil bli utført i samsvar med prinsippene i Helsinki-erklæringen, prinsippene for GCP og alle (hvis noen) gjeldende regulatoriske krav er avgjørende.

NHS Grampian Biorepository vil gi de anonymiserte prøvene som skal brukes til denne studien. NHS Grampian Biorepository har allerede etisk godkjenning på plass for denne typen studier. Forsknings- og utviklingsgodkjenning vil bli søkt.

Metoder Blodprøver fra pasienter med HCC og fra alderstilpassede friske kontroller, lagret i National bio-repository Scotland, vil bli testet for sirkulerende miR-221 og miR-222 uttrykk ved hjelp av sanntids revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT) -qPCR). På samme måte vil nivåer av miR-221 og miR-222 bli vurdert i paret kreft og friskt levervev fra pasienter med HCC.

Prøveanalyse vil finne sted i Institute for Health and Wellbeing Research-laboratoriet ved Robert Gordon University (RGU) - Aberdeen.

Resultater fra analyse av prøver og kvantifisering av mikroRNA via RT-qPCR vil bli utført av sjefsetterforskeren sammen med forskerteamet i laboratoriefasilitetene.

Prøver vil bli analysert for å vurdere miR-221 og miR-222 overekspresjon mellom tumoralt og ikke-tumoralt levervev og for å vurdere korrelasjonen mellom dette og sirkulerende miR-221 og miR-222. Sirkulerende nivåer vil bli sammenlignet med resultater fra alderstilpassede friske kontroller.

Depotansvarlig for dataene generert av studien vil være hovedetterforskeren.

Prøver vil bli lagret i laboratoriefasilitetene ved RGU og det er kun hovedetterforsker og forskerteam som vil ha tilgang til.

Data generert av studien vil bli samlet inn i et regneark som vil bli skreddersydd og holdes på intranettet med tilgang begrenset til CI og forskningsteamet.

Anonymiserte data på datafiler vil bli lagret i passordbeskyttede databaser som bare er tilgjengelige for studieforskerne.

Alle skriftlige filer vil bli lagret i låste fyllingsskap i en sikker butikk ved Robert Gordon University med unntak av samtykker som lagres av NHS Grampian Biorepository.

University of Aberdeen og NHS Grampian overvåkingsprosedyrer vil bli fulgt.

På slutten av forskningen vil prøvene bli lagret av forskerteamet i påvente av etisk godkjenning for bruk i et annet prosjekt, mens dataene generert av studien vil bli lagret i passordbeskyttede databaser som bare er tilgjengelige for studieforskerne.

Samtykkeprosess NHS Grampian Biorepository søker informert samtykke fra pasienter for innsamling av vevsprøver og blod gjennom en dedikert forskningssykepleier og bruk av et pasientinformasjonsark og et samtykkeskjema som er en del av NHS Grampian Biorepository-dokumentasjonen.

Et samtykke vil bli innhentet for alle prøvene brukt i denne studien i henhold til Biorepository-samtykkeprosessen.

Prøveflytskjema

• Fem frosne sammenkoblede hepatisk tumoralt og ikke-tumoralt vev og fem frosne plasmaprøver hentet fra pasienter med HCC og lagret i National Bio-Repository Scotland (HCC Group, HCC). Fem frivillige alderstilpassede friske kontroller vil bli rekruttert for å relatere uttrykket av sirkulerende miRNA (Plasma Control Group, PCG).
• Parede frosne HCC-vevsprøver og deres tilstøtende ikke-kreftfremkallende normale lever vil bli samlet i RNA-stabiliseringsrør og lagret ved -80C inntil videre analyse og miRNA-ekstraksjon i henhold til protokoll. Gjennomsnittlig størrelse på prøven vil være 2 x 10 mm i diameter.
• Blodprøver tatt fra både HCC Group og PCG (8-10 ml, i BD Vacutainer K3-EDTA blodprøverør) vil bli samlet inn. Alle prøver vil bli sendt til Bio-Repository for videre behandling og deretter analyse og miRNA-ekstraksjon i henhold til protokoll.
• Resultatene av miRNA-ekstraksjon fra paret HCC/ikke-kreftvev vil bli sammenlignet og fra HCC Group plasma vil bli sammenlignet med matchet plasma fra kontroller (PCG Group).