Klinische Bedeutung der hepatischen und zirkulierenden microRNAs miR-221 und miR-222 beim hepatozellulären Karzinom

Hintergrund und Begründung Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die sechsthäufigste Krebsart weltweit und die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache.

Die chirurgische Resektion bleibt die beste kurative Behandlungsoption für Patienten mit klinischem Leberkrebs im Stadium A der Barcelona-Clinic Clinic (BCLC) im Stadium A und hat selbst im fortgeschritteneren Stadium B mit multifokaler Erkrankung oder begrenzter Gefäßinvasion Vorteile gezeigt.

Obwohl kurative Behandlungen eine 5-Jahres-Überlebensrate von 50–70 % bieten, liegt die Rezidivrate 5 Jahre nach der Operation bei bis zu 70 %. Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich, um prognostische Faktoren für ein Wiederauftreten und Überleben zu identifizieren.

MicroRNAs sind eine Klasse kleiner nichtkodierender RNA-Moleküle, die als Schlüsselregulatoren der Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose und Embryonalentwicklung fungieren und die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene fein abstimmen. Sie wirken je nach Zielgen als Onkogene oder Tumorsuppressoren. Bei HCC wurde über die Hoch- oder Herunterregulierung einiger Cluster von microRNAs mit anschließender Aktivierung molekularer Netzwerke wie b-Catenin, Ras, TGF-b, JAK/STAT und der Schaffung eines hochkontrollierten Rückkopplungsmechanismus berichtet.

Ihre Beteiligung an der Krebsentstehung stellt einen wichtigen Forschungsbereich für die Entwicklung ihrer klinischen Anwendungen dar: Diagnostik, Überwachung und Therapie. MicroRNA-Profile können zwischen normalem und krebsartigem Gewebe unterscheiden, Ursprungsgewebe identifizieren und auch verschiedene Subtypen oder spezifische onkogene Anomalien unterscheiden. Tatsächlich sind microRNA-Fehlexpressionsmuster genauer bei der Identifizierung des Ursprungs von Tumoren, der sonst schwer zu bestimmen wäre, was darauf hindeutet, dass Tumore deutlicher ein einzigartiges microRNA-Expressionsprofil im Gewebe beibehalten.

MicroRNAs könnten auch als Frühdiagnose-Biomarker für die Patientennachsorge nützlich sein.

Bei der Entstehung von Lebertumoren ist die Rolle von miR-221 und miR-222 noch nicht vollständig geklärt. Frühere Studien zeigten, dass miR-221 in 83 % der HCC-Tumorproben im Vergleich zu entsprechendem zirrhotischem Gewebe hochreguliert war.

Bei HCC-Patienten wurde im Vergleich zu gesunden, normalen Kontrollpersonen eine erhöhte Expression von miR-221 im Serum festgestellt, was mit dem Vorhandensein anderer schlechter Prognosefaktoren und schlechteren Ergebnissen nach Leberresektion verbunden war.

Die Extraktion von microRNAs aus Leberproben ist durch die Möglichkeit der Tumorresektion oder die Möglichkeit, bei jedem Patienten eine Leberbiopsie durchzuführen, begrenzt. Im Gegenteil: Eine Blutprobe lässt sich leicht entnehmen und zur Analyse aufbewahren. Derzeit ist kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Expression von miR-221 und miR-222 im Lebergewebe (tumoral und nicht tumoral) und den zirkulierenden miR-221- und miR-222-Spiegeln nachgewiesen.

Die Bestätigung dieser Korrelation würde es ermöglichen, einen Grenzwert für die zirkulierenden Werte zu ermitteln, der als Ersatzmarker verwendet werden könnte, um HCC-Patienten in Phase-3-Studien einzubeziehen, ohne dass eine Leberbiopsie erforderlich ist, die aus klinischen Gründen und entsprechend häufig kontraindiziert ist Richtlinien.

Hierbei handelt es sich um eine Pilotstudie zur Bewertung der Korrelation zwischen der Überexpression von miR-221 und miR-222 in gepaarten Tumor-/Nicht-Tumor-Lebergewebe- und Blutproben bei Patienten mit HCC und zur Ermittlung eines Grenzwerts für die zirkulierenden Spiegel zur Verwendung als Ersatzmarker in klinischen Studien.

In dieser Studie soll daher untersucht werden, ob die miR-221- und miR-222-Expression im Blut mit der Gewebeexpression korreliert und ob die zirkulierenden Werte als Ersatz für eine Überexpression im Tumorlebergewebe verwendet werden könnten.

Sollte diese Auswertung eine starke Korrelation und Zuverlässigkeit zirkulierender miRNAs bei der Diagnose und Nachsorge von HCC zeigen, könnten zukünftige klinische Studien, die auf diese miRNAs und ihre zugehörigen Signalwege abzielen, davon profitieren, dass dies als herkömmliche Praxis übernommen wird, anstatt die Gewebewerte anhand dieser beurteilen zu müssen Leberbiopsien.

Der Versuch wird in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki, den Grundsätzen der GCP und allen (sofern vorhanden) geltenden behördlichen Anforderungen durchgeführt.

Das NHS Grampian Biorepository stellt die anonymisierten Proben zur Verfügung, die für diese Studie verwendet werden sollen. Das NHS Grampian Biorepository verfügt bereits über eine ethische Genehmigung für diese Art von Studien. Es wird eine Genehmigung für Forschung und Entwicklung eingeholt.

Methoden Blutproben von Patienten mit HCC und von altersentsprechenden gesunden Kontrollpersonen, die im National Bio-Repository Scotland gelagert werden, werden mithilfe der Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT) auf zirkulierende miR-221- und miR-222-Expression getestet -qPCR). In ähnlicher Weise werden die miR-221- und miR-222-Spiegel bei Patienten mit gepaartem Krebs und gesundem Lebergewebe mit HCC bestimmt.

Die Probenanalyse erfolgt im Labor des Institute for Health and Wellbeing Research der Robert Gordon University (RGU) – Aberdeen.

Die Ergebnisse der Probenanalyse und Quantifizierung von microRNAs mittels RT-qPCR werden vom Chefforscher zusammen mit dem Forschungsteam in den Laboreinrichtungen durchgeführt.

Die Proben werden analysiert, um die Überexpression von miR-221 und miR-222 zwischen tumoralem und nicht-tumoralem Lebergewebe zu beurteilen und die Korrelation zwischen dieser und zirkulierendem miR-221 und miR-222 zu beurteilen. Die zirkulierenden Werte werden mit den Ergebnissen altersentsprechender gesunder Kontrollpersonen verglichen.

Der Verwalter der durch die Studie generierten Daten ist der Chefermittler.

Die Proben werden in den Laboreinrichtungen der RGU gelagert und nur der Chefforscher und das Forschungsteam haben Zugriff darauf.

Die durch die Studie generierten Daten werden in einer maßgeschneiderten Tabelle gesammelt und im Intranet gespeichert, wobei der Zugriff nur dem CI und dem Forschungsteam vorbehalten ist.

Anonymisierte Daten in Computerdateien werden in passwortgeschützten Datenbanken gespeichert, auf die nur die Studienleiter zugreifen können.

Alle schriftlichen Unterlagen werden in verschlossenen Abfüllschränken in einem sicheren Lager an der Robert Gordon University aufbewahrt, mit Ausnahme der Einwilligungen, die vom NHS Grampian Biorepository aufbewahrt werden.

Die Überwachungsverfahren der University of Aberdeen und des NHS Grampian werden befolgt.

Am Ende der Forschung werden die Proben vom Forschungsteam bis zur ethischen Genehmigung zur Verwendung in einem anderen Projekt gespeichert, während die durch die Studie generierten Daten in passwortgeschützten Datenbanken gespeichert werden, auf die nur die Studienforscher zugreifen können.

Einwilligungsprozess Das NHS Grampian Biorepository holt die informierte Einwilligung der Patienten zur Entnahme von Gewebeproben und Blut durch eine engagierte Forschungsschwester ein und verwendet ein Patienteninformationsblatt und ein Einverständnisformular, die Teil der Dokumentation des NHS Grampian Biorepository sind.

Für alle in dieser Studie verwendeten Proben wird gemäß dem Biorepository-Einwilligungsverfahren eine Einwilligung eingeholt.

Prozessflussdiagramm

• Fünf gefrorene gepaarte Lebertumor- und Nichttumorgewebeproben und fünf gefrorene Plasmaproben, die von Patienten mit HCC entnommen und im National Bio-Repository Scotland (HCC Group, HCC) gelagert wurden. Fünf freiwillige, altersentsprechende gesunde Kontrollpersonen werden rekrutiert, um die Expression zirkulierender miRNAs (Plasma Control Group, PCG) zu ermitteln.
• Gepaarte gefrorene HCC-Gewebeproben und die angrenzende nicht krebsartige normale Leber werden in RNA-Stabilisierungsröhrchen gesammelt und bis zur weiteren Analyse und miRNA-Extraktion gemäß Protokoll bei -80 °C gelagert. Die durchschnittliche Größe der Probe beträgt 2 x 10 mm im Durchmesser.
• Es werden Blutproben der HCC-Gruppe und der PCG (8–10 ml, in BD Vacutainer K3-EDTA-Blutentnahmeröhrchen) entnommen. Alle Proben werden zur weiteren Verarbeitung und anschließenden Analyse und miRNA-Extraktion gemäß Protokoll an das Bio-Repository gesendet.
• Die Ergebnisse der miRNA-Extraktion aus gepaarten HCC/nicht krebsartigen Geweben werden verglichen und das Plasma der HCC-Gruppe wird mit dem passenden Plasma der Kontrollen (PCG-Gruppe) verglichen.