Significado clínico dos microRNAs hepáticos e circulantes miR-221 e miR-222 no carcinoma hepatocelular

Antecedentes e Justificativa O carcinoma hepatocelular (CHC) é o sexto câncer mais prevalente em todo o mundo e é a terceira causa de mortalidade relacionada ao câncer.

A ressecção cirúrgica continua sendo a melhor opção de tratamento curativo para pacientes com câncer de fígado da Clínica Barcelona (BCLC) estágio A da doença e tem mostrado benefícios mesmo no estágio B mais avançado com doença multifocal ou invasão vascular limitada.

Apesar dos tratamentos curativos oferecerem uma taxa de sobrevida em 5 anos de 50-70%, as taxas de recorrência em 5 anos após a cirurgia chegam a 70%. Portanto, mais esforços são necessários para identificar fatores prognósticos de recorrência e sobrevida.

MicroRNAs são uma classe de pequenas moléculas de RNAs não codificantes, que atuam como reguladores chave da proliferação celular, diferenciação, apoptose e desenvolvimento embrionário, ajustando finamente a expressão gênica no nível pós-transcricional. Eles agem como oncogenes ou supressores de tumor, dependendo dos genes-alvo. No CHC, tem sido relatada a regulação positiva ou negativa de alguns aglomerados de microRNAs, com subsequente ativação de redes moleculares como b-catenina, Ras, TGF-b, JAK/STAT e criação de um mecanismo de feedback altamente controlado.

O seu envolvimento na carcinogénese representa uma importante área de investigação para o desenvolvimento das suas aplicações clínicas: diagnóstico, monitorização e terapêutica. Os perfis de microRNA podem distinguir entre tecido normal e canceroso, identificar o tecido de origem e também discriminar diferentes subtipos ou anormalidades oncogênicas específicas. De fato, os padrões de expressão incorreta de microRNA são mais precisos na identificação da origem de tumores que, de outra forma, são difíceis de serem determinados, sugerindo que os tumores mantêm mais claramente um perfil de expressão de microRNA de tecido único.

MicroRNAs também podem ser úteis como biomarcadores de diagnóstico precoce para acompanhamento de pacientes.

Na tumorigênese hepática, o papel do miR-221 e miR-222 não foi completamente elucidado. Estudos anteriores mostraram que miR-221 foi regulado positivamente em 83% das amostras tumorais de CHC quando comparado com tecido cirrótico compatível.

O aumento da expressão de miR-221 sérico foi encontrado em pacientes com CHC em comparação com controles normais saudáveis, o que foi associado à presença de outros fatores de mau prognóstico e a piores resultados após a ressecção hepática.

A extração de microRNAs de amostras de fígado é limitada pela capacidade de ressecção do tumor ou a possibilidade de realizar uma biópsia hepática em cada paciente. Pelo contrário, uma amostra de sangue é fácil de ser coletada e armazenada para análise. Atualmente, não foi claramente estabelecida uma correlação entre a expressão de miR-221 e miR-222 no tecido hepático (tumoral e não tumoral) e os níveis circulantes de miR-221 e miR-222.

A confirmação dessa correlação permitiria identificar um corte dos níveis circulantes que poderia ser usado como um marcador substituto para incluir pacientes com CHC em estudos de fase 3 sem a necessidade de biópsia hepática, muitas vezes contra-indicada por razões clínicas e de acordo com diretrizes.

Este é um estudo piloto para avaliar a correlação entre a superexpressão de miR-221 e miR-222 em tecido hepático tumoral/não tumoral pareado e amostras de sangue em pacientes com CHC e para identificar um ponto de corte para os níveis circulantes para usar como um marcador substituto em ensaios clínicos.

Este estudo, portanto, visa avaliar se a expressão de miR-221 e miR-222 no sangue se correlaciona com a expressão tecidual e se os níveis circulantes podem ser usados ​​como substitutos da superexpressão no tecido tumoral do fígado.

Caso essa avaliação mostre uma forte correlação e confiabilidade dos miRNAs circulantes, no diagnóstico e acompanhamento do CHC, futuros ensaios clínicos direcionados a esses miRNAs e suas vias relacionadas podem se beneficiar com sua adoção como prática convencional, em vez da necessidade de avaliar os níveis teciduais de biópsias hepáticas.

O estudo será conduzido em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque, os princípios do GCP e todos (se houver) requisitos regulamentares aplicáveis ​​são essenciais.

O NHS Grampian Biorepository fornecerá as amostras anônimas a serem usadas para este estudo. O NHS Grampian Biorepository já possui aprovação ética para esses tipos de estudos. A aprovação de Pesquisa e Desenvolvimento será buscada.

Métodos Amostras de sangue de pacientes com CHC e de controles saudáveis ​​pareados por idade, armazenadas no biorrepositório nacional da Escócia, serão testadas para expressão circulante de miR-221 e miR-222 por meio de Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa em Tempo Real (RT -qPCR). Da mesma forma, os níveis de miR-221 e miR-222 serão avaliados em câncer pareado e tecido hepático saudável de pacientes com HCC.

A análise da amostra será realizada no laboratório do Institute for Health and Wellbeing Research da Robert Gordon University (RGU) - Aberdeen.

Os resultados da análise das amostras e quantificação de microRNAs via RT-qPCR serão realizados pelo investigador principal juntamente com a equipa de investigação nas instalações do laboratório.

As amostras serão analisadas para avaliar a superexpressão de miR-221 e miR-222 entre tecido hepático tumoral e não tumoral e para avaliar a correlação entre este e os miR-221 e miR-222 circulantes. Os níveis circulantes serão comparados aos resultados de controles saudáveis ​​pareados por idade.

O guardião dos dados gerados pelo estudo será o Investigador Chefe.

As amostras serão armazenadas nas instalações laboratoriais da RGU e somente o investigador principal e a equipe de pesquisa terão acesso.

Os dados gerados pelo estudo serão coletados em uma planilha que será sob medida e mantida na intranet com acesso restrito apenas ao IC e à equipe de pesquisa.

Dados anonimizados em arquivos de computador serão armazenados em bancos de dados protegidos por senha, acessíveis apenas aos investigadores do estudo.

Todos os arquivos escritos serão armazenados em armários de preenchimento trancados em um depósito seguro na Robert Gordon University, com exceção dos consentimentos que são armazenados pelo NHS Grampian Biorepository.

Os procedimentos de monitoramento da Universidade de Aberdeen e do NHS Grampian serão seguidos.

Ao final da pesquisa, as amostras serão armazenadas pela equipe de pesquisa, aguardando aprovação ética para uso em outro projeto, enquanto os dados gerados pelo estudo serão armazenados em bancos de dados protegidos por senha, acessíveis apenas aos pesquisadores do estudo.

Processo de consentimento O NHS Grampian Biorepository busca o consentimento informado dos pacientes para a coleta de amostras de tecido e sangue por meio de uma enfermeira de pesquisa dedicada e o uso de uma folha de informações do paciente e um formulário de consentimento que fazem parte da documentação do NHS Grampian Biorepository.

Um consentimento será obtido para todas as amostras usadas neste estudo de acordo com o processo de consentimento do Biorepositório.

Fluxograma de teste

• Cinco amostras congeladas de tecido hepático tumoral e não tumoral pareado e cinco amostras de plasma congeladas obtidas de pacientes com HCC e armazenadas no National Bio-Repository Scotland (HCC Group, HCC). Cinco controles voluntários saudáveis ​​pareados por idade serão recrutados para relacionar a expressão de miRNAs circulantes (Plasma Control Group, PCG).
• Espécimes de tecido HCC congelados pareados e seu fígado normal não canceroso adjacente serão coletados em tubos de estabilização de RNA e armazenados a -80C até análise posterior e extração de miRNAs de acordo com o protocolo. O tamanho médio da amostra será de 2 por 10 mm de diâmetro.
• Amostras de sangue coletadas do Grupo HCC e PCG (8-10ml, em tubos de coleta de sangue BD Vacutainer K3-EDTA) serão coletadas. Todas as amostras serão enviadas para o Bio-Repositório para posterior processamento e, em seguida, análise e extração de miRNAs conforme protocolo.
• Os resultados da extração de miRNAs de tecidos pareados HCC/não cancerosos serão comparados e do plasma do Grupo HCC será comparado ao plasma pareado dos controles (Grupo PCG).