Klinische betekenis van lever- en circulerende microRNA's miR-221 en miR-222 bij hepatocellulair carcinoom

Achtergrond en achtergrond Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd de zesde meest voorkomende vorm van kanker en de derde oorzaak van aan kanker gerelateerde sterfte.

Chirurgische resectie blijft de beste curatieve behandelingsoptie voor patiënten met klinische Barcelona-Clinic Liver Cancer (BCLC) stadium A-ziekte en het heeft voordelen aangetoond, zelfs in het meer gevorderde stadium B met multifocale ziekte of beperkte vasculaire invasie.

Ondanks curatieve behandelingen die een 5-jaars overlevingspercentage van 50-70% bieden, zijn de recidiefpercentages 5 jaar na de operatie zo hoog als 70%. Daarom zijn er meer inspanningen nodig om prognostische factoren voor recidief en overleving te identificeren.

MicroRNA's zijn een klasse van kleine niet-coderende RNA-moleculen, die fungeren als belangrijke regulatoren van celproliferatie, differentiatie, apoptose en embryonale ontwikkeling, waarbij genexpressie nauwkeurig wordt afgestemd op post-transcriptioneel niveau. Ze werken als oncogenen of tumoronderdrukkers, afhankelijk van de doelgenen. In HCC is melding gemaakt van de opwaartse of neerwaartse regulatie van een paar clusters van microRNA's, met een daaropvolgende activering van moleculaire netwerken zoals b-catenine, Ras, TGF-b, JAK/STAT en het creëren van een sterk gecontroleerd feedbackmechanisme.

Hun betrokkenheid bij carcinogenese vormt een belangrijk onderzoeksgebied voor de ontwikkeling van hun klinische toepassingen: diagnostiek, monitoring en therapieën. MicroRNA-profielen kunnen onderscheid maken tussen normaal en kankerweefsel, weefsel van oorsprong identificeren en ook verschillende subtypes of specifieke oncogene afwijkingen onderscheiden. Patronen voor verkeerde expressie van microRNA zijn inderdaad nauwkeuriger bij het identificeren van de oorsprong van tumoren die anders moeilijk te bepalen zijn, wat suggereert dat tumoren duidelijker een uniek weefsel-microRNA-expressieprofiel behouden.

MicroRNA's kunnen ook nuttig zijn als biomarkers voor vroege diagnose voor de follow-up van patiënten.

Bij levertumorigenese is de rol van miR-221 en miR-222 niet volledig opgehelderd. Eerdere studies toonden aan dat miR-221 werd opgereguleerd in 83% van de HCC-tumormonsters in vergelijking met gematcht cirrotisch weefsel.

Verhoogde expressie van serum miR-221 werd gevonden bij HCC-patiënten in vergelijking met gezonde normale controles, wat geassocieerd was met de aanwezigheid van andere slechte prognostische factoren en met slechtere resultaten na leverresectie.

De extractie van microRNA's uit levermonsters wordt beperkt door het vermogen om de tumor te verwijderen of de mogelijkheid om bij elke patiënt een leverbiopsie uit te voeren. Integendeel, een bloedmonster is eenvoudig te verzamelen en te bewaren voor analyse. Op dit moment is er geen duidelijk verband vastgesteld tussen de expressie van miR-221 en miR-222 in het leverweefsel (tumoraal en niet-tumoraal) en de circulerende miR-221- en miR-222-niveaus.

De bevestiging van deze correlatie zou het mogelijk maken om een ​​cut-off van circulerende niveaus te identificeren die als surrogaatmarker zou kunnen worden gebruikt om HCC-patiënten in fase 3-onderzoeken op te nemen zonder dat een leverbiopsie nodig is, wat vaak om klinische redenen gecontra-indiceerd is en volgens richtlijnen.

Dit is een pilootstudie om de correlatie tussen de overexpressie van miR-221 en miR-222 in gepaard tumoraal/niet-tumoraal leverweefsel en bloedmonsters bij patiënten met HCC te evalueren en om een ​​grenswaarde voor de circulerende niveaus te identificeren om als surrogaatmarker te gebruiken in klinische proeven.

Deze studie heeft daarom tot doel te evalueren of miR-221- en miR-222-expressie in het bloed correleert met weefselexpressie en of de circulerende niveaus kunnen worden gebruikt als een surrogaat van overexpressie in het tumorale leverweefsel.

Mocht deze evaluatie een sterke correlatie en betrouwbaarheid aantonen van circulerende miRNA's, bij de diagnose en follow-up van HCC, dan zouden toekomstige klinische onderzoeken gericht op deze miRNA's en hun gerelateerde routes er baat bij kunnen hebben als dit als conventionele praktijk wordt aangenomen in plaats van de noodzaak om weefselniveaus te beoordelen van lever biopsieën.

De proef zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki, de principes van GCP en alle (indien van toepassing) toepasselijke wettelijke vereisten zijn essentieel.

NHS Grampian Biorepository zal de geanonimiseerde monsters leveren die voor dit onderzoek zullen worden gebruikt. NHS Grampian Biorepository heeft al ethische goedkeuring voor dit soort onderzoeken. Er zal om goedkeuring voor onderzoek en ontwikkeling worden gevraagd.

Methoden Bloedmonsters van patiënten met HCC en van gezonde controles van dezelfde leeftijd, opgeslagen in de National bio-repository Scotland, zullen worden getest op circulerende miR-221- en miR-222-expressie door middel van Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT -qPCR). Evenzo zullen de niveaus van miR-221 en miR-222 worden beoordeeld bij patiënten met gepaarde kanker en gezond leverweefsel met HCC.

De monsteranalyse vindt plaats in het laboratorium van het Institute for Health and Wellbeing Research aan de Robert Gordon University (RGU) - Aberdeen.

Resultaten van de analyse van monsters en kwantificering van microRNA's via RT-qPCR zullen worden uitgevoerd door de hoofdonderzoeker samen met het onderzoeksteam in de laboratoriumfaciliteiten.

Er zullen monsters worden geanalyseerd om de overexpressie van miR-221 en miR-222 tussen tumoraal en niet-tumoraal leverweefsel te beoordelen en om de correlatie tussen deze en circulerende miR-221 en miR-222 te beoordelen. Circulerende niveaus zullen worden vergeleken met resultaten van gezonde controles van dezelfde leeftijd.

De bewaarder van de gegevens die door het onderzoek worden gegenereerd, is de hoofdonderzoeker.

Monsters worden opgeslagen in de laboratoriumfaciliteiten van RGU en alleen de hoofdonderzoeker en het onderzoeksteam hebben er toegang toe.

Gegevens die door het onderzoek worden gegenereerd, worden verzameld in een spreadsheet die op maat wordt gemaakt en op het intranet wordt bewaard met alleen toegang tot de CI en het onderzoeksteam.

Geanonimiseerde gegevens op computerbestanden worden opgeslagen in met een wachtwoord beveiligde databases die alleen toegankelijk zijn voor de onderzoekers van het onderzoek.

Alle geschreven bestanden worden opgeslagen in afgesloten vulkasten in een beveiligde opslag aan de Robert Gordon University, met uitzondering van toestemmingen die worden opgeslagen door NHS Grampian Biorepository.

De controleprocedures van de Universiteit van Aberdeen en NHS Grampian zullen worden gevolgd.

Aan het einde van het onderzoek worden de monsters opgeslagen door het onderzoeksteam in afwachting van ethische goedkeuring voor gebruik in een ander project, terwijl de gegevens die door het onderzoek worden gegenereerd, worden opgeslagen in met een wachtwoord beveiligde databases die alleen toegankelijk zijn voor de onderzoekers van het onderzoek.

Toestemmingsproces NHS Grampian Biorepository vraagt ​​geïnformeerde toestemming van patiënten voor het verzamelen van weefselmonsters en bloed via een toegewijde onderzoeksverpleegkundige en het gebruik van een patiënteninformatieblad en een toestemmingsformulier die deel uitmaken van de NHS Grampian Biorepository-documentatie.

Er zal toestemming worden verkregen voor alle monsters die in dit onderzoek worden gebruikt volgens het toestemmingsproces van Biorepository.

Proefstroomschema

• Vijf bevroren gepaarde levertumorweefsel en niet-tumorweefsel en vijf bevroren plasmamonsters verkregen van patiënten met HCC en opgeslagen in de National Bio-Repository Scotland (HCC Group, HCC). Vijf vrijwillige, op leeftijd afgestemde gezonde controles zullen worden aangeworven om de expressie van circulerende miRNA's te relateren (Plasma Control Group, PCG).
• Gepaarde ingevroren HCC-weefselspecimens en hun aangrenzende niet-kankerachtige normale lever worden verzameld in RNA-stabilisatiebuizen en bewaard bij -80°C tot verdere analyse en miRNA-extractie volgens het protocol. De gemiddelde grootte van het monster is 2 bij 10 mm in diameter.
• Er worden bloedmonsters afgenomen van zowel HCC Group als PCG (8-10 ml, in BD Vacutainer K3-EDTA-bloedafnamebuisjes). Alle monsters worden naar Bio-Repository gestuurd voor verdere verwerking en vervolgens analyse en miRNA-extractie volgens protocol.
• De resultaten van miRNAs-extractie uit gepaarde HCC/niet-kankerachtige weefsels zullen worden vergeleken en van HCC Group-plasma zal worden vergeleken met het gematchte plasma van controles (PCG Group).