Znaczenie kliniczne wątrobowych i krążących mikroRNA miR-221 i miR-222 w raku wątrobowokomórkowym

Tło i uzasadnienie Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest szóstym najczęściej występującym rakiem na świecie i trzecią przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami.

Resekcja chirurgiczna pozostaje najlepszą opcją leczenia dla pacjentów z rakiem wątroby w stadium A klinicznym kliniki barcelońskiej (BCLC) i przynosi korzyści nawet w bardziej zaawansowanym stadium B z chorobą wieloogniskową lub ograniczoną inwazją naczyniową.

Pomimo zabiegów leczniczych oferujących 5-letnie przeżycie na poziomie 50-70%, odsetek nawrotów po 5 latach od operacji sięga nawet 70%. Dlatego potrzebne są dalsze wysiłki w celu zidentyfikowania czynników prognostycznych nawrotu i przeżycia.

MikroRNA to klasa małych niekodujących cząsteczek RNA, które działają jako kluczowe regulatory proliferacji, różnicowania, apoptozy i rozwoju embrionalnego komórek, precyzyjnie dostrajając ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym. W zależności od genów docelowych działają jako onkogeny lub supresory nowotworów. W HCC odnotowano regulację w górę lub w dół kilku klastrów mikroRNA, z późniejszą aktywacją sieci molekularnych, takich jak b-katenina, Ras, TGF-b, JAK / STAT i stworzenie wysoce kontrolowanego mechanizmu sprzężenia zwrotnego.

Ich udział w karcynogenezie stanowi ważny obszar badań dla rozwoju ich zastosowań klinicznych: diagnostyki, monitorowania i terapii. Profile mikroRNA umożliwiają rozróżnienie między tkanką normalną a nowotworową, identyfikację tkanki pochodzenia, a także rozróżnianie różnych podtypów lub specyficznych nieprawidłowości onkogennych. Rzeczywiście, wzorce błędnej ekspresji mikroRNA są dokładniejsze w identyfikowaniu pochodzenia guzów, które w inny sposób są trudne do określenia, co sugeruje, że guzy wyraźniej zachowują unikalny profil ekspresji mikroRNA w tkankach.

MikroRNA mogą być również przydatne jako biomarkery wczesnej diagnozy do obserwacji pacjentów.

W nowotworzeniu wątroby rola miR-221 i miR-222 nie została całkowicie wyjaśniona. Poprzednie badania wykazały, że miR-221 był regulowany w górę w 83% próbek guza HCC w porównaniu z dopasowaną tkanką z marskością wątroby.

U pacjentów z HCC stwierdzono zwiększoną ekspresję miR-221 w surowicy w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej, co wiązało się z obecnością innych niekorzystnych czynników prognostycznych i gorszym rokowaniem po resekcji wątroby.

Ekstrakcja mikroRNA z próbek wątroby jest ograniczona możliwością resekcji guza lub możliwością wykonania biopsji wątroby u każdego pacjenta. Wręcz przeciwnie, próbkę krwi można łatwo pobrać i przechowywać do analizy. Obecnie nie ustalono jednoznacznie korelacji między ekspresją miR-221 i miR-222 w tkance wątroby (nowotworowej i nienowotworowej) a poziomami krążących miR-221 i miR-222.

Potwierdzenie tej korelacji pozwoliłoby na określenie wartości odcięcia poziomów krążących, które mogłyby być wykorzystane jako marker zastępczy w celu włączenia pacjentów z HCC do badań III fazy bez konieczności wykonywania biopsji wątroby, co jest często przeciwwskazane ze względów klinicznych i zgodnie z wytyczne.

Jest to badanie pilotażowe mające na celu ocenę korelacji między nadekspresją miR-221 i miR-222 w sparowanych nowotworowych/nienowotworowych tkankach wątroby i próbkach krwi u pacjentów z HCC oraz określenie wartości odcięcia dla poziomów w krążeniu do wykorzystania jako marker zastępczy w badaniach klinicznych.

Badanie to ma zatem na celu ocenę, czy ekspresja miR-221 i miR-222 we krwi koreluje z ekspresją w tkankach i czy poziomy w krążeniu można wykorzystać jako substytut nadekspresji w guzowej tkance wątroby.

Jeśli ta ocena wykaże silną korelację i wiarygodność krążących miRNA w diagnostyce i obserwacji HCC, przyszłe badania kliniczne ukierunkowane na te miRNA i związane z nimi szlaki mogą odnieść korzyści z przyjęcia tego jako konwencjonalnej praktyki zamiast potrzeby oceny poziomów tkankowych z biopsje wątroby.

Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej, zasadami GCP i wszystkimi (jeśli istnieją) obowiązującymi wymogami prawnymi.

NHS Grampian Biorepository dostarczy zanonimizowane próbki do wykorzystania w tym badaniu. NHS Grampian Biorepository posiada już aprobatę etyczną dla tego typu badań. Zostanie poproszona o zgodę na badania i rozwój.

Metody Próbki krwi od pacjentów z HCC i od zdrowych osób z grupy kontrolnej dobranej pod względem wieku, przechowywane w National bio-repository Scotland, będą badane pod kątem ekspresji krążących miR-221 i miR-222 za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT -qPCR). Podobnie, poziomy miR-221 i miR-222 będą oceniane w parach raka i zdrowej tkanki wątroby od pacjentów z HCC.

Analiza próbki odbędzie się w laboratorium Institute for Health and Wellbeing Research na Uniwersytecie Roberta Gordona (RGU) w Aberdeen.

Wyniki analizy próbek i oznaczania ilościowego mikroRNA metodą RT-qPCR zostaną przeprowadzone przez głównego badacza wraz z zespołem badawczym w zapleczu laboratoryjnym.

Próbki będą analizowane w celu oceny nadekspresji miR-221 i miR-222 między nowotworową i nienowotworową tkanką wątroby oraz w celu oceny korelacji między tym a krążącymi miR-221 i miR-222. Poziomy w krążeniu zostaną porównane z wynikami zdrowych osób kontrolnych dobranych pod względem wieku.

Opiekunem danych wygenerowanych w ramach badania będzie Główny Badacz.

Próbki będą przechowywane w zapleczu laboratoryjnym RGU, do którego dostęp będzie miał tylko główny badacz i zespół badawczy.

Dane wygenerowane w ramach badania zostaną zebrane w specjalnie przygotowanym arkuszu kalkulacyjnym, który będzie przechowywany w intranecie z dostępem ograniczonym tylko do IK i zespołu badawczego.

Zanonimizowane dane w plikach komputerowych będą przechowywane w chronionych hasłem bazach danych, do których dostęp mają wyłącznie badacze.

Wszystkie zapisane pliki będą przechowywane w zamkniętych szafkach do napełniania w bezpiecznym magazynie na Uniwersytecie Roberta Gordona, z wyjątkiem zgód, które są przechowywane przez NHS Grampian Biorepository.

Przestrzegane będą procedury monitorowania Uniwersytetu w Aberdeen i NHS Grampian.

Po zakończeniu badań próbki będą przechowywane przez zespół badawczy do czasu zatwierdzenia etycznego do wykorzystania w innym projekcie, podczas gdy dane wygenerowane w ramach badania będą przechowywane w chronionych hasłem bazach danych, do których dostęp mają wyłącznie badacze.

Proces uzyskiwania zgody NHS Grampian Biorepository poszukuje świadomej zgody pacjentów na pobieranie próbek tkanek i krwi za pośrednictwem wyznaczonej pielęgniarki badawczej oraz przy użyciu karty informacyjnej pacjenta i formularza zgody, które są częścią dokumentacji NHS Grampian Biorepository.

Zgoda zostanie uzyskana dla wszystkich próbek użytych w tym badaniu zgodnie z procesem zgody Biorepository.

Schemat próbny

• Pięć zamrożonych sparowanych tkanek nowotworowych i nienowotworowych wątroby oraz pięć zamrożonych próbek osocza uzyskanych od pacjentów z HCC i przechowywanych w National Bio-Repository Scotland (HCC Group, HCC). Zrekrutowanych zostanie pięciu dobrowolnych zdrowych osób kontrolnych dobranych pod względem wieku w celu powiązania ekspresji krążących miRNA (grupa kontrolna osocza, PCG).
• Sparowane zamrożone próbki tkanek HCC i przylegająca do nich nienowotworowa normalna wątroba zostaną zebrane w probówkach do stabilizacji RNA i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu dalszej analizy i ekstrakcji miRNA zgodnie z protokołem. Średni rozmiar próbki będzie wynosił 2 na 10 mm średnicy.
• Zostaną pobrane próbki krwi pobrane zarówno od grupy HCC, jak i PCG (8-10 ml, do probówek do pobierania krwi BD Vacutainer K3-EDTA). Wszystkie próbki zostaną przesłane do Bio-Repository w celu dalszego przetwarzania, a następnie analizy i ekstrakcji miRNA zgodnie z protokołem.
• Wyniki ekstrakcji miRNA ze sparowanych tkanek HCC/nienowotworowych zostaną porównane, a osocze grupy HCC zostanie porównane z dopasowanym osoczem kontroli (grupa PCG).