Nové molekulárně spektrometrické biomarkery v krevní plazmě jako nástroj časné diagnostiky u HCC

Předměty: Nábor pacientů bude prováděn na Klinice gastroenterologie, hepatologie a metabolismu Interní kliniky 1. LF UK a FN Praha (MUH). Výběr velikostí sady vzorků je objasněn níže (podkapitola Sběr dat a statistická analýza).

Skupina A: ~100 pacientů s jaterní cirhózou s diagnózou HCC potvrzenou podle standardních diagnostických kritérií publikovaných nedávno Evropskou asociací pro studium jater (EASL). Zařazeni budou pacienti všech stádií HCC podle Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), na našem oddělení ~40-50 pacientů ročně.

Skupina B: ~100 pacientů s jaterní cirhózou bez HCC nebo dysplastických uzlin v době vyšetření a během následujících 12 měsíců sledování. Pacienti budou sledováni pravidelnými klinickými návštěvami s obecnými laboratorními vyšetřeními a ultrazvukem jater v 6měsíčních intervalech (doporučené sledování u pacientů s jaterní cirhózou s rizikem rozvoje HCC).

Skupina C: ~50 zdravých dobrovolníků bez jaterní cirhózy (rekruti Armády ČR, aktivní vojenský personál Armády ČR).

Rutinně zkoumaná biochemie (např. celkový protein, albumin, alfa feto protein atd.) všech studovaných skupin bude korelována s nově identifikovanými spektroskopickými/metabolomickými biomarkery. Podepsaný informovaný souhlas bude zajištěn od každého subjektu zahrnutého do studie (kritéria pro zařazení/vyloučení uvedená níže). Příprava plazmy: Podle již zavedeného postupu pro odběr vzorků, přípravu a analýzu bude všechna krev ošetřená antikoagulantem (K3EDTA) všech subjektů odebrána venepunkcí a centrifugována při 1500 x g po dobu 10 minut. Plazmatické frakce budou ihned zmraženy (skladovány při -80 °C) a dopraveny na VŠCHT Praha ke spektroskopické a metabolomické analýze. Před každou analýzou budou vzorky rozmraženy při pokojové teplotě (~25 °C) a centrifugovány přes 0,45 μm membránový filtr při 13 000 × g po dobu 10 minut. Následně budou provedena spektrální měření (v případě ROA a Ramana bude přidán kinetický zhášeč fluorescence pro potlačení spektrálně širokého pozadí s velkou amplitudou, které překrývá zájmové signály a je způsobeno vysokým obsahem fluorescence molekuly v krevní plazmě).

Spektroskopická analýza: Pro splnění cílů projektu využijí řešitelé unikátní kombinaci dvou chiroptických metod - ECD a ROA - doplněných o nepolarizované varianty - IR absorpční a Ramanovu spektroskopii. Zatímco ECD detekuje rozdíl v absorpci mezi levým a pravým kruhově polarizovaným zářením, komerčně dostupné nastavení ROA s rozptýlenou kruhovou polarizací pracuje s malým rozdílem intenzity mezi kruhově polarizovanými složkami v rozptýleném světle pomocí nepolarizovaného dopadajícího záření. Obě tyto metody vykazují vlastní citlivost na 3D strukturu a konformaci několika chirálních biomolekul, jako jsou peptidy, proteiny, sacharidy, nukleové kyseliny a další (20). Některé z těchto typů sloučenin mohou patřit mezi ty, jejichž 3D struktura nebo koncentrace v krevní plazmě se během vývoje HCC mění. Zatímco ECD citlivě odráží celkovou konformaci chirálních molekul, ROA se zaměřuje na konkrétní typy vazeb; a tudíž odráží spíše konstrukční detaily. Kromě pásů peptidové kostry z pravidelných sekundárních strukturních prvků, konkrétně helixů a beta-listů, ROA spektra obsahují odlišné pásy ze smyček a závitů a jako takové; poskytují informace o terciární struktuře. Současné použití ECD, ROA a nepolarizovaných spektroskopických metod proto zvýší spolehlivost jednotlivých nálezů.

Navíc kombinace různých analytických přístupů a technologií, které dosud nebyly zavedeny v klinické praxi, zvýší pravděpodobnost detekce menších změn ve spektrálních vlastnostech odrážejících konformační a koncentrační změny molekul souvisejících s HCC a/nebo jejich metabolitů v krevní plazmě. Pokud je nám známo, naše laboratoř na Katedře analytické chemie VŠCHT Praha má jako jediná na světě k dispozici všechny tyto techniky a zároveň má dlouhodobé zkušenosti s analýzou biofluidů. Veškeré vybavení použité pro analýzy je komerčně dostupné, a proto; mohou být zakoupeny klinickými laboratořemi.