Nye molekylære spektrometriske biomarkører i blodplasma som et tidligt diagnostisk værktøj i HCC

Emner: Patientrekruttering vil blive udført på afdelingen for gastroenterologi, hepatologi og stofskifte på den interne klinik på det første medicinske fakultet ved Charles University og det militære universitetshospital i Prag (MUH Prag). Udvælgelsen af ​​prøvesætstørrelser er afklaret nedenfor (underafsnit Dataindsamling og statistisk analyse).

Gruppe A: ~100 patienter med levercirrhose med HCC-diagnosen bekræftet i henhold til standard diagnostiske kriterier offentliggjort for nylig af European Association for the Study of the Lever (EASL). Patienter i alle HCC stadier ifølge Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), i vores afdeling ~40-50 patienter om året, vil blive inkluderet.

Gruppe B: ~100 patienter med levercirrhose uden HCC eller dysplastiske knuder på undersøgelsestidspunktet og inden for de næste 12 måneders opfølgning. Patienterne vil blive overvåget ved regelmæssige kliniske besøg med generelle laboratorieundersøgelser og leverultralyd i 6-måneders intervaller (anbefalet overvågning for patienter med levercirrhose med risiko for HCC-udvikling).

Gruppe C: ~50 raske frivillige uden levercirrhose (rekrutter fra den tjekkiske hær, aktive militærpersoner fra den tjekkiske hær).

Rutinemæssigt undersøgt biokemi (f.eks. totalt protein, albumin, alfa-fetoprotein osv.) af alle undersøgte grupper vil blive korreleret med de nyligt identificerede spektroskopiske/metabolomiske biomarkører. Et underskrevet informeret samtykke vil blive sikret fra hvert forsøgsperson inkluderet i undersøgelsen (inklusions-/eksklusionskriterier angivet nedenfor). Plasmaforberedelse: Efter den allerede etablerede procedure for prøveindsamling, -forberedelse og -analyse, vil det hele antikoagulant-behandlede (K3EDTA) blod fra alle forsøgspersoner blive opsamlet ved venepunktur og centrifugeret ved 1500 × g i 10 minutter. Plasmafraktionerne fryses straks (opbevares ved -80 °C) og transporteres til UCT Prag for spektroskopiske og metabolomiske analyser. Forud for hver analyse vil prøverne blive optøet ved stuetemperatur (~25 °C) og centrifugeret gennem et 0,45 μm membranfilter ved 13.000 × g i 10 minutter. Efterfølgende vil spektralmålingerne blive udført (i tilfælde af ROA og Raman vil en kinetisk fluorescensdæmper blive tilføjet for at undertrykke den spektralt brede baggrund med stor amplitude, som overlapper de interessante signaler og er forårsaget af et højt indhold af fluorescerende molekyler i blodplasma).

Spektroskopisk analyse: For at opfylde projektets mål vil efterforskerne anvende en unik kombination af to kirotiske metoder - ECD og ROA - suppleret med ikke-polariserede varianter - IR-absorption og Raman-spektroskopi. Mens ECD detekterer absorptionsforskellen mellem venstre og højre cirkulært polariseret stråling, fungerer den kommercielt tilgængelige spredte cirkulære polarisering ROA-opsætning med den lille intensitetsforskel mellem de cirkulært polariserede komponenter i det spredte lys ved hjælp af ikke-polariseret indfaldende stråling. Begge disse metoder udviser iboende følsomhed over for 3D-strukturen og konformationen af ​​adskillige chirale biomolekyler, såsom peptider, proteiner, saccharider, nukleinsyrer og andre (20). Nogle af disse typer forbindelser kan være blandt dem, hvis 3D-struktur eller koncentration i blodplasma varierer under HCC-udvikling. Mens ECD følsomt afspejler den overordnede konformation af chirale molekyler, fokuserer ROA på særlige bindingstyper; og afspejler således snarere de strukturelle detaljer. Ud over peptid-rygradsbåndene fra regulære sekundære strukturelementer, specifikt helixer og beta-sheets, indeholder ROA-spektrene distinkte bånd fra loops og turns og som sådan; de giver oplysninger om den tertiære struktur. Derfor vil den samtidige brug af ECD, ROA og de ikke-polariserede spektroskopiske metoder øge pålideligheden af ​​de særlige fund.

Desuden vil en kombination af forskellige analytiske tilgange og teknologier, der endnu ikke er etableret i klinisk praksis, øge sandsynligheden for at detektere mindre ændringer inden for de spektrale træk, der afspejler konformations- og koncentrationsændringerne af de HCC-relaterede molekyler og/eller deres metabolitter i blodplasma. Så vidt vi ved, er vores laboratorium ved Institut for Analytisk Kemi, UCT Prag det eneste i verden, der har alle disse teknikker tilgængelige, samtidig med at vi har en langvarig erfaring med biofluidanalyse. Alt udstyr brugt til analyserne er kommercielt tilgængeligt og dermed; kan købes af kliniske laboratorier.