Uudet molekyylispektrometriset biomarkkerit veriplasmassa varhaisen diagnoosin työkaluna HCC:ssä

Aiheet: Potilaiden rekrytointi suoritetaan Kaarlen yliopiston ensimmäisen lääketieteellisen tiedekunnan sisäklinikan gastroenterologian, hepatologian ja aineenvaihdunnan osastolla ja Prahan sotilasyliopistosairaalassa (MUH Praha). Otosjoukkokokojen valintaa selvennetään alla (alakohta Tiedonkeruu ja tilastollinen analyysi).

Ryhmä A: ~100 maksakirroosipotilasta, joilla on HCC-diagnoosi, joka on vahvistettu äskettäin European Association for the Research of Maksan (EASL) julkaisemien standardidiagnostisten kriteerien mukaisesti. Mukaan otetaan kaikki Barcelonan Clinic Liver Cancer (BCLC) -vaiheen potilaat, osastollamme ~40-50 potilasta vuodessa.

Ryhmä B: ~100 potilasta, joilla on maksakirroosi ilman HCC:tä tai dysplastisia kyhmyjä tutkimushetkellä ja seuraavien 12 kuukauden aikana. Potilaita seurataan säännöllisillä kliinisillä käynneillä yleisillä laboratoriotutkimuksilla ja maksan ultraäänellä 6 kuukauden välein (suositeltu seuranta potilaille, joilla on maksakirroosi ja HCC:n kehittymisen riski).

Ryhmä C: ~50 tervettä vapaaehtoista, joilla ei ole maksakirroosia (Tšekin armeijan värvätyt, Tšekin armeijan aktiivinen sotilashenkilöstö).

Kaikkien tutkittujen ryhmien rutiininomaisesti tutkitut biokemiat (esim. kokonaisproteiini, albumiini, alfafetoproteiini jne.) korreloidaan äskettäin tunnistettujen spektroskooppisten/metabolisten biomarkkerien kanssa. Allekirjoitettu tietoinen suostumus varmistetaan jokaiselta tutkimukseen osallistuvalta henkilöltä (alla luetellut sisällyttämis-/poissulkemiskriteerit). Plasman valmistus: Jo vakiintuneen näytteenotto-, valmistelu- ja analyysimenettelyn mukaisesti kaikkien koehenkilöiden antikoagulantilla käsitelty (K3EDTA) kokoveri kerätään laskimopunktiolla ja sentrifugoidaan 1500 × g:llä 10 minuuttia. Plasmafraktiot pakastetaan välittömästi (säilytetään -80 °C:ssa) ja kuljetetaan UCT Prahaan spektroskooppisia ja metabolomisia analyysejä varten. Ennen jokaista analyysiä näytteet sulatetaan huoneenlämpötilassa (~ 25 °C) ja sentrifugoidaan 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi nopeudella 13 000 × g 10 minuuttia. Tämän jälkeen suoritetaan spektrimittaukset (ROA:n ja Ramanin tapauksessa kineettinen fluoresenssisammuttaja lisätään vaimentamaan laajan amplitudin spektrisesti laajaa taustaa, joka menee päällekkäin kiinnostavien signaalien kanssa ja johtuu korkeasta fluoresoivasta pitoisuudesta. molekyylejä veriplasmassa).

Spektroskooppinen analyysi: Hankkeen tavoitteiden saavuttamiseksi tutkijat käyttävät ainutlaatuista yhdistelmää kahdesta kiroptisesta menetelmästä - ECD ja ROA - joita täydentävät polarisoimattomat variantit - IR-absorptio ja Raman-spektroskopia. Vaikka ECD havaitsee vasemman ja oikeanpuoleisen ympyräpolarisoidun säteilyn välisen absorptioeron, kaupallisesti saatavilla oleva sironneen ympyräpolarisaation ROA-asetus toimii sironneen valon ympyräpolarisoituneiden komponenttien välisellä pienellä intensiteettierolla käyttämällä polarisoimatonta tulevaa säteilyä. Molemmat näistä menetelmistä osoittavat luontaista herkkyyttä useiden kiraalisten biomolekyylien, kuten peptidien, proteiinien, sakkaridien, nukleiinihappojen ja muiden 3D-rakenteelle ja konformaatiolle (20). Jotkut tämän tyyppisistä yhdisteistä saattavat kuulua niihin, joiden 3D-rakenne tai pitoisuus veriplasmassa vaihtelee HCC:n kehittymisen aikana. Vaikka ECD heijastaa herkästi kiraalisten molekyylien yleistä konformaatiota, ROA keskittyy tiettyihin sidostyyppeihin; ja siten heijastaa pikemminkin rakenteellisia yksityiskohtia. Säännöllisistä toissijaisista rakenneelementeistä, erityisesti helikseistä ja beeta-arkeista, peräisin olevien peptidirunkojuovien lisäksi ROA-spektrit sisältävät erillisiä vyöhykkeitä silmukoista ja käännöksistä ja sellaisenaan; ne antavat tietoa tertiaarisesta rakenteesta. Siksi ECD:n, ROA:n ja polarisoimattomien spektroskooppisten menetelmien samanaikainen käyttö lisää tiettyjen löydösten luotettavuutta.

Lisäksi erilaisten analyyttisten lähestymistapojen ja tekniikoiden yhdistäminen, joita ei ole vielä vakiintunut kliinisessä käytännössä, lisää todennäköisyyttä havaita pieniä muutoksia spektriominaisuuksissa, jotka heijastavat HCC:hen liittyvien molekyylien ja/tai niiden metaboliittien konformaatio- ja pitoisuusmuutoksia veriplasmassa. Tietojemme mukaan laboratoriomme analyyttisen kemian laitoksella UCT Prahassa on ainoa maailmassa, jossa on saatavilla kaikki nämä tekniikat, ja samalla meillä on pitkäaikainen kokemus biofluidianalyysistä. Kaikki analyyseihin käytetyt laitteet ovat kaupallisesti saatavilla ja siten; kliiniset laboratoriot voivat ostaa.