Nowe biomarkery spektrometryczne molekularne w osoczu krwi jako narzędzie wczesnej diagnostyki HCC

Tematy: Rekrutacja pacjentów będzie prowadzona w Klinice Gastroenterologii, Hepatologii i Metabolizmu Kliniki Wewnętrznej I Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Karola i Wojskowego Szpitala Uniwersyteckiego w Pradze (MUH Praga). Wybór wielkości zestawu prób wyjaśniono poniżej (podsekcja Gromadzenie danych i analiza statystyczna).

Grupa A: ~100 pacjentów z marskością wątroby z rozpoznaniem HCC potwierdzonym według standardowych kryteriów diagnostycznych opublikowanych niedawno przez European Association for the study of the liver (EASL). Pacjenci we wszystkich stadiach HCC według Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), na naszym oddziale ~40-50 pacjentów rocznie, zostaną włączeni.

Grupa B: ~100 pacjentów z marskością wątroby bez raka wątrobowokomórkowego lub guzków dysplastycznych w momencie badania iw ciągu kolejnych 12 miesięcy obserwacji. Pacjenci będą monitorowani poprzez regularne wizyty kliniczne z ogólnymi badaniami laboratoryjnymi i USG wątroby w odstępach 6-miesięcznych (zalecany nadzór u pacjentów z marskością wątroby zagrożonych rozwojem HCC).

Grupa C: ~50 zdrowych ochotników bez marskości wątroby (rekruci armii czeskiej, czynny personel wojskowy armii czeskiej).

Rutynowo badana biochemia (np. białko całkowite, albumina, białko alfa feto itp.) wszystkich badanych grup zostanie skorelowana z nowo zidentyfikowanymi biomarkerami spektroskopowymi/metabolomicznymi. Podpisana świadoma zgoda zostanie uzyskana od każdego uczestnika biorącego udział w badaniu (kryteria włączenia/wyłączenia wymienione poniżej). Przygotowanie osocza: Zgodnie z już ustaloną procedurą pobierania próbek, przygotowania i analizy, pełna krew leczona antykoagulantem (K3EDTA) od wszystkich pacjentów zostanie pobrana przez nakłucie żyły i odwirowana przy 1500 x g przez 10 minut. Frakcje osocza zostaną natychmiast zamrożone (przechowywane w temperaturze -80°C) i przetransportowane do UCT Praga w celu przeprowadzenia analiz spektroskopowych i metabolomicznych. Przed każdą analizą próbki zostaną rozmrożone w temperaturze pokojowej (~25°C) i odwirowane przez filtr membranowy 0,45 μm przy 13 000 x g przez 10 minut. Następnie przeprowadzone zostaną pomiary spektralne (w przypadku ROA i Ramana zostanie dodany kinetyczny wygaszacz fluorescencji w celu stłumienia szerokiego spektralnie tła o dużej amplitudzie, które nakłada się na interesujące nas sygnały i jest spowodowane dużą zawartością fluorescencji cząsteczki w osoczu krwi).

Analiza spektroskopowa: Aby zrealizować cele projektu, badacze wykorzystają unikalną kombinację dwóch metod chiropterycznych – ECD i ROA – uzupełnionych o warianty niespolaryzowane – absorpcję IR i spektroskopię Ramana. Podczas gdy ECD wykrywa różnicę absorpcji między promieniowaniem spolaryzowanym kołowo w lewo iw prawo, dostępny na rynku układ ROA z rozproszoną polaryzacją kołową działa z niewielką różnicą intensywności między składnikami spolaryzowanymi kołowo w świetle rozproszonym przy użyciu niespolaryzowanego promieniowania padającego. Obie te metody wykazują naturalną wrażliwość na trójwymiarową strukturę i konformację kilku chiralnych biomolekuł, takich jak peptydy, białka, sacharydy, kwasy nukleinowe i inne (20). Niektóre z tych rodzajów związków mogą należeć do tych, których trójwymiarowa struktura lub stężenie w osoczu krwi zmienia się podczas rozwoju HCC. Podczas gdy ECD z wyczuciem odzwierciedla ogólną konformację cząsteczek chiralnych, ROA koncentruje się na określonych typach wiązań; a zatem odzwierciedla raczej szczegóły konstrukcyjne. Oprócz pasm peptydowo-szkieletowych z regularnych elementów struktury drugorzędowej, w szczególności helis i arkuszy beta, widma ROA zawierają odrębne pasma z pętli i zwojów i jako takie; dostarczają informacji o strukturze trzeciorzędowej. Dlatego jednoczesne zastosowanie metod ECD, ROA i spektroskopii niespolaryzowanej zwiększy wiarygodność poszczególnych wyników.

Ponadto połączenie różnych podejść analitycznych i technologii, które nie zostały jeszcze ugruntowane w praktyce klinicznej, zwiększy prawdopodobieństwo wykrycia niewielkich zmian w obrębie cech widmowych odzwierciedlających zmiany konformacyjne i stężenia cząsteczek związanych z HCC i/lub ich metabolitów w osoczu krwi. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nasze laboratorium na Wydziale Chemii Analitycznej UCT Praga jest jedynym na świecie, które dysponuje wszystkimi tymi technikami, a jednocześnie ma wieloletnie doświadczenie w analizie biopłynów. Cały sprzęt używany do analiz jest dostępny w handlu, a zatem; mogą być zakupione przez laboratoria kliniczne.