Neuartige molekulare spektrometrische Biomarker im Blutplasma als frühes diagnostisches Instrument bei HCC

Themen: Die Patientenrekrutierung wird an der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Stoffwechsel der Internen Klinik der Ersten Medizinischen Fakultät der Karlsuniversität und des Militäruniversitätskrankenhauses in Prag (MUH Prag) durchgeführt. Die Auswahl der Stichprobengrößen wird weiter unten erläutert (Unterabschnitt Datenerhebung und statistische Analyse).

Gruppe A: ~100 Patienten mit Leberzirrhose, bei denen die HCC-Diagnose gemäß den kürzlich von der European Association for the Study of the Liver (EASL) veröffentlichten diagnostischen Standardkriterien bestätigt wurde. Patienten aller HCC-Stadien nach Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), in unserer Abteilung ~40-50 Patienten pro Jahr, werden eingeschlossen.

Gruppe B: ~100 Patienten mit Leberzirrhose ohne HCC oder dysplastische Knoten zum Zeitpunkt der Untersuchung und innerhalb der nächsten 12 Monate der Nachbeobachtung. Die Patienten werden durch regelmäßige klinische Besuche mit allgemeinen Laboruntersuchungen und Leberultraschall in 6-Monats-Intervallen überwacht (empfohlene Überwachung für Patienten mit Leberzirrhose mit Risiko für die Entwicklung eines HCC).

Gruppe C: ~50 gesunde Freiwillige ohne Leberzirrhose (Rekruten der tschechischen Armee, aktives Militärpersonal der tschechischen Armee).

Die routinemäßig untersuchte Biochemie (z. B. Gesamtprotein, Albumin, Alpha-Feto-Protein usw.) aller untersuchten Gruppen wird mit den neu identifizierten spektroskopischen/metabolomischen Biomarkern korreliert. Von jedem in die Studie eingeschlossenen Probanden wird eine unterschriebene Einverständniserklärung eingeholt (Einschluss-/Ausschlusskriterien sind unten aufgeführt). Plasmavorbereitung: Nach dem bereits etablierten Verfahren zur Probenentnahme, -vorbereitung und -analyse wird das mit Antikoagulanzien behandelte (K3EDTA) Vollblut aller Probanden durch Venenpunktion entnommen und 10 Minuten lang bei 1500 × g zentrifugiert. Die Plasmafraktionen werden sofort eingefroren (bei -80 °C gelagert) und für spektroskopische und metabolomische Analysen an das UCT Prag transportiert. Vor jeder Analyse werden die Proben bei Raumtemperatur (~25 °C) aufgetaut und 10 Minuten lang bei 13.000 × g durch einen 0,45-μm-Membranfilter zentrifugiert. Anschließend werden die spektralen Messungen durchgeführt (im Fall von ROA und Raman wird ein kinetischer Fluoreszenzlöscher hinzugefügt, um den spektral breiten Hintergrund mit großer Amplitude zu unterdrücken, der die interessierenden Signale überlagert und durch einen hohen Anteil an Fluoreszenz verursacht wird Moleküle im Blutplasma).

Spektroskopische Analyse: Um die Projektziele zu erreichen, werden die Forscher eine einzigartige Kombination aus zwei chiroptischen Methoden - ECD und ROA - verwenden, ergänzt durch nicht-polarisierte Varianten - IR-Absorption und Raman-Spektroskopie. Während ECD den Absorptionsunterschied zwischen links- und rechtszirkular polarisierter Strahlung erfasst, arbeitet der kommerziell erhältliche gestreute zirkular polarisierte ROA-Aufbau mit dem kleinen Intensitätsunterschied zwischen den zirkular polarisierten Komponenten im gestreuten Licht unter Verwendung von nicht polarisierter einfallender Strahlung. Beide dieser Verfahren zeigen eine inhärente Empfindlichkeit gegenüber der 3D-Struktur und Konformation mehrerer chiraler Biomoleküle, wie Peptide, Proteine, Saccharide, Nukleinsäuren und andere (20). Einige dieser Arten von Verbindungen könnten zu denen gehören, deren 3D-Struktur oder Konzentration im Blutplasma während der HCC-Entwicklung variiert. Während ECD die Gesamtkonformation chiraler Moleküle empfindlich widerspiegelt, konzentriert sich ROA auf bestimmte Bindungstypen; und spiegelt somit eher die strukturellen Details wider. Zusätzlich zu den Banden des Peptidrückgrats von regulären Sekundärstrukturelementen, insbesondere Helices und Beta-Faltblättern, enthalten die ROA-Spektren deutliche Banden von Schleifen und Windungen und als solche; sie geben Auskunft über die Tertiärstruktur. Daher wird die gleichzeitige Verwendung von ECD, ROA und den nicht-polarisierten spektroskopischen Methoden die Zuverlässigkeit der jeweiligen Ergebnisse erhöhen.

Darüber hinaus erhöht die Kombination verschiedener analytischer Ansätze und Technologien, die noch nicht in der klinischen Praxis etabliert sind, die Wahrscheinlichkeit, geringfügige Änderungen innerhalb der spektralen Merkmale zu erkennen, die die Konformations- und Konzentrationsänderungen der HCC-verwandten Moleküle und/oder ihrer Metaboliten im Blutplasma widerspiegeln. Nach unserem besten Wissen ist unser Labor am Department of Analytical Chemistry, UCT Prague das einzige auf der Welt, das alle diese Techniken zur Verfügung hat und gleichzeitig über langjährige Erfahrung mit der Analyse von Bioflüssigkeiten verfügt. Alle für die Analysen verwendeten Geräte sind im Handel erhältlich und somit; können von klinischen Labors erworben werden.