Novos Biomarcadores Espectrométricos Moleculares no Plasma Sanguíneo como Ferramenta de Diagnóstico Precoce no CHC

Sujeitos: O recrutamento de pacientes será realizado no Departamento de Gastroenterologia, Hepatologia e Metabolismo da Clínica Interna da Primeira Faculdade de Medicina da Universidade Charles e do Hospital Universitário Militar de Praga (MUH Praga). A seleção de tamanhos de conjuntos de amostra é esclarecida abaixo (subseção Coleta de dados e análise estatística).

Grupo A: ~100 pacientes com cirrose hepática com diagnóstico de CHC confirmado de acordo com critérios diagnósticos padrão publicados recentemente pela Associação Europeia para o estudo do fígado (EASL). Serão incluídos pacientes de todos os estágios do CHC de acordo com o Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), em nosso departamento ~40-50 pacientes por ano.

Grupo B: ~100 pacientes com cirrose hepática sem CHC ou nódulos displásicos no momento do exame e nos próximos 12 meses de acompanhamento. Os pacientes serão acompanhados por visitas clínicas regulares com exames laboratoriais gerais e ultrassonografia hepática em intervalos de 6 meses (vigilância recomendada para pacientes com cirrose hepática em risco de desenvolvimento de CHC).

Grupo C: ~50 voluntários saudáveis ​​sem cirrose hepática (recrutas do Exército tcheco, militares ativos do Exército tcheco).

A bioquímica examinada rotineiramente (por exemplo, proteína total, albumina, proteína alfa feto, etc.) de todos os grupos estudados será correlacionada com os biomarcadores espectroscópicos/metabolômicos recém-identificados. Um consentimento informado assinado será obtido de cada sujeito incluído no estudo (critérios de inclusão/exclusão listados abaixo). Preparo do plasma: Seguindo o procedimento já estabelecido para coleta, preparo e análise da amostra, o sangue total tratado com anticoagulante (K3EDTA) de todos os indivíduos será coletado por punção venosa e centrifugado a 1500 × g por 10 minutos. As frações de plasma serão congeladas imediatamente (armazenadas a -80 °C) e transportadas para a UCT Praga para análises espectroscópicas e metabolômicas. Antes de cada análise, as amostras serão descongeladas à temperatura ambiente (~25 °C) e centrifugadas através de um filtro de membrana de 0,45 μm a 13.000 × g por 10 minutos. Posteriormente, as medições espectrais serão realizadas (no caso de ROA e Raman, um quencher de fluorescência cinética será adicionado para suprimir o fundo espectralmente amplo de grande amplitude, que se sobrepõe aos sinais de interesse e é causado por um alto teor de fluorescência moléculas no plasma sanguíneo).

Análise espectroscópica: Para atender aos objetivos do projeto, os pesquisadores utilizarão uma combinação única de dois métodos quiróticos - ECD e ROA - complementados por variantes não polarizadas - absorção de infravermelho e espectroscopia Raman. Enquanto o ECD detecta a diferença de absorção entre a radiação polarizada circularmente à esquerda e à direita, a configuração ROA de polarização circular espalhada comercialmente disponível opera com a pequena diferença de intensidade entre os componentes polarizados circularmente na luz espalhada usando radiação incidente não polarizada. Ambos os métodos exibem sensibilidade inerente à estrutura 3D e conformação de várias biomoléculas quirais, como peptídeos, proteínas, sacarídeos, ácidos nucléicos e outros (20). Alguns desses tipos de compostos podem estar entre aqueles cuja estrutura 3D ou concentração no plasma sanguíneo varia durante o desenvolvimento do CHC. Enquanto o ECD reflete sensivelmente a conformação geral das moléculas quirais, o ROA se concentra em tipos de ligação específicos; e assim, reflete bastante os detalhes estruturais. Além das bandas do esqueleto peptídico de elementos regulares da estrutura secundária, especificamente hélices e folhas beta, os espectros ROA contêm bandas distintas de loops e voltas e, como tal; eles fornecem informações sobre a estrutura terciária. Portanto, o uso simultâneo de ECD, ROA e os métodos espectroscópicos não polarizados aumentará a confiabilidade dos achados específicos.

Além disso, combinar diferentes abordagens analíticas e tecnologias ainda não estabelecidas na prática clínica aumentará a probabilidade de detectar pequenas alterações nas características espectrais refletindo as alterações conformacionais e de concentração das moléculas relacionadas ao CHC e/ou seus metabólitos no plasma sanguíneo. Até onde sabemos, nosso laboratório no Departamento de Química Analítica da UCT Praga é o único no mundo a ter todas essas técnicas disponíveis, possuindo simultaneamente uma longa experiência com análise de biofluidos. Todos os equipamentos utilizados para as análises são comercialmente disponíveis e, portanto; podem ser adquiridos por laboratórios clínicos.