Nuovi biomarcatori spettrometrici molecolari nel plasma sanguigno come strumento diagnostico precoce nell'HCC

Soggetti: Il reclutamento dei pazienti sarà effettuato presso il Dipartimento di Gastroenterologia, Epatologia e Metabolismo presso la Clinica Interna della Prima Facoltà di Medicina dell'Università Carlo e l'Ospedale Universitario Militare di Praga (MUH Praga). La selezione delle dimensioni del campione è chiarita di seguito (sottosezione Raccolta dati e analisi statistica).

Gruppo A: ~100 pazienti con cirrosi epatica con diagnosi di HCC confermata secondo i criteri diagnostici standard pubblicati di recente dall'Associazione europea per lo studio del fegato (EASL). Saranno inclusi pazienti di tutti gli stadi di HCC secondo Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), nel nostro dipartimento ~ 40-50 pazienti all'anno.

Gruppo B: ~100 pazienti con cirrosi epatica senza HCC o noduli displastici al momento dell'esame ed entro i successivi 12 mesi di follow-up. I pazienti saranno monitorati da visite cliniche regolari con esami di laboratorio generali ed ecografia epatica a intervalli di 6 mesi (sorveglianza raccomandata per i pazienti con cirrosi epatica a rischio di sviluppo di HCC).

Gruppo C: ~50 volontari sani senza cirrosi epatica (reclute dell'esercito ceco, personale militare attivo dell'esercito ceco).

La biochimica esaminata di routine (ad es. proteine ​​totali, albumina, proteina alfa feto, ecc.) di tutti i gruppi studiati sarà correlata con i biomarcatori spettroscopici/metabolomici appena identificati. Un consenso informato firmato sarà assicurato da ogni soggetto incluso nello studio (criteri di inclusione/esclusione elencati di seguito). Preparazione del plasma: seguendo la procedura già stabilita per la raccolta, la preparazione e l'analisi dei campioni, il sangue intero trattato con anticoagulante (K3EDTA) di tutti i soggetti sarà raccolto mediante prelievo venoso e centrifugato a 1500 × g per 10 minuti. Le frazioni plasmatiche saranno immediatamente congelate (conservate a -80 °C) e trasportate all'UCT di Praga per le analisi spettroscopiche e metabolomiche. Prima di ogni analisi, i campioni saranno scongelati a temperatura ambiente (~25 °C) e centrifugati attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm a 13.000 × g per 10 minuti. Successivamente, verranno effettuate le misure spettrali (nel caso di ROA e Raman, verrà aggiunto un quencher di fluorescenza cinetica per sopprimere il fondo spettrale ampio di grande ampiezza, che si sovrappone ai segnali di interesse ed è causato da un alto contenuto di fluorescenza molecole nel plasma sanguigno).

Analisi spettroscopica: per raggiungere gli obiettivi del progetto, i ricercatori utilizzeranno una combinazione unica di due metodi chirottici - ECD e ROA - integrati da varianti non polarizzate - assorbimento IR e spettroscopia Raman. Mentre l'ECD rileva la differenza di assorbimento tra la radiazione polarizzata circolarmente sinistra e destra, l'impostazione ROA di polarizzazione circolare diffusa disponibile in commercio opera con la piccola differenza di intensità tra i componenti polarizzati circolarmente nella luce diffusa utilizzando la radiazione incidente non polarizzata. Entrambi questi metodi mostrano una sensibilità intrinseca alla struttura 3D e alla conformazione di diverse biomolecole chirali, come peptidi, proteine, saccaridi, acidi nucleici e altri (20). Alcuni di questi tipi di composti potrebbero essere tra quelli la cui struttura 3D o concentrazione nel plasma sanguigno varia durante lo sviluppo dell'HCC. Mentre l'ECD riflette in modo sensibile la conformazione complessiva delle molecole chirali, il ROA si concentra su particolari tipi di legame; e quindi, riflette piuttosto i dettagli strutturali. Oltre alle bande del peptide-dorsale da elementi regolari della struttura secondaria, in particolare eliche e foglietti beta, gli spettri ROA contengono bande distinte da loop e turni e, come tali; forniscono informazioni sulla struttura terziaria. Pertanto, l'uso simultaneo di ECD, ROA e metodi spettroscopici non polarizzati migliorerà l'affidabilità dei risultati particolari.

Inoltre, la combinazione di diversi approcci analitici e tecnologie non ancora consolidate nella pratica clinica aumenterà la probabilità di rilevare piccoli cambiamenti all'interno delle caratteristiche spettrali che riflettono le alterazioni conformazionali e di concentrazione delle molecole correlate all'HCC e/o dei loro metaboliti nel plasma sanguigno. Per quanto ne sappiamo, il nostro laboratorio presso il Dipartimento di Chimica Analitica, UCT Praga è l'unico al mondo ad avere tutte queste tecniche disponibili, avendo contemporaneamente una lunga esperienza con l'analisi dei biofluidi. Tutte le apparecchiature utilizzate per le analisi sono disponibili in commercio e, quindi; possono essere acquistati dai laboratori clinici.