Nuevos biomarcadores espectrométricos moleculares en plasma sanguíneo como herramienta de diagnóstico temprano en CHC

Sujetos: El reclutamiento de pacientes se realizará en el Departamento de Gastroenterología, Hepatología y Metabolismo en la Clínica Interna de la Primera Facultad de Medicina de la Universidad Charles y el Hospital Universitario Militar de Praga (MUH Praga). La selección de tamaños de conjuntos de muestras se aclara a continuación (subsección Recopilación de datos y análisis estadístico).

Grupo A: ~100 pacientes con cirrosis hepática con diagnóstico de CHC confirmado de acuerdo con los criterios de diagnóstico estándar publicados recientemente por la Asociación Europea para el estudio del hígado (EASL). Se incluirán pacientes de todos los estadios de CHC según Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), en nuestro servicio ~40-50 pacientes al año.

Grupo B: ~100 pacientes con cirrosis hepática sin CHC o nódulos displásicos en el momento del examen y dentro de los siguientes 12 meses de seguimiento. Los pacientes serán monitoreados mediante visitas clínicas periódicas con exámenes generales de laboratorio y ultrasonido hepático en intervalos de 6 meses (vigilancia recomendada para pacientes con cirrosis hepática en riesgo de desarrollar CHC).

Grupo C: ~50 voluntarios sanos sin cirrosis hepática (reclutas del ejército checo, personal militar activo del ejército checo).

La bioquímica examinada de forma rutinaria (por ejemplo, proteína total, albúmina, proteína alfa feto, etc.) de todos los grupos estudiados se correlacionará con los biomarcadores espectroscópicos/metabolómicos recientemente identificados. Se obtendrá un consentimiento informado firmado de cada sujeto incluido en el estudio (los criterios de inclusión/exclusión se enumeran a continuación). Preparación del plasma: siguiendo el procedimiento ya establecido para la recogida, preparación y análisis de muestras, se recogerá toda la sangre tratada con anticoagulante (K3EDTA) de todos los sujetos mediante venopunción y se centrifugará a 1500 × g durante 10 minutos. Las fracciones de plasma se congelarán inmediatamente (almacenadas a -80 °C) y se transportarán a la UCT de Praga para realizar análisis espectroscópicos y metabolómicos. Antes de cada análisis, las muestras se descongelarán a temperatura ambiente (~25 °C) y se centrifugarán a través de un filtro de membrana de 0,45 μm a 13 000 × g durante 10 minutos. Posteriormente, se realizarán las medidas espectrales (en el caso de ROA y Raman, se añadirá un quencher cinético de fluorescencia para suprimir el fondo espectralmente amplio de gran amplitud, que se superpone a las señales de interés y está provocado por un alto contenido de fluorescencia). moléculas en el plasma sanguíneo).

Análisis espectroscópico: para cumplir con los objetivos del proyecto, los investigadores utilizarán una combinación única de dos métodos quirópticos, ECD y ROA, complementados con variantes no polarizadas, absorción IR y espectroscopia Raman. Mientras que ECD detecta la diferencia de absorción entre la radiación polarizada circularmente izquierda y derecha, la configuración ROA de polarización circular dispersa disponible comercialmente opera con la pequeña diferencia de intensidad entre los componentes polarizados circularmente en la luz dispersada usando radiación incidente no polarizada. Ambos métodos muestran una sensibilidad inherente a la estructura 3D y la conformación de varias biomoléculas quirales, como péptidos, proteínas, sacáridos, ácidos nucleicos y otros (20). Algunos de estos tipos de compuestos podrían estar entre aquellos cuya estructura 3D o concentración en el plasma sanguíneo varía durante el desarrollo del CHC. Mientras que ECD refleja con sensibilidad la conformación general de las moléculas quirales, ROA se enfoca en tipos de enlaces particulares; y por lo tanto, refleja más bien los detalles estructurales. Además de las bandas del esqueleto peptídico de los elementos regulares de la estructura secundaria, específicamente hélices y láminas beta, los espectros de ROA contienen distintas bandas de bucles y vueltas y, como tales; proporcionan información sobre la estructura terciaria. Por lo tanto, el uso simultáneo de ECD, ROA y métodos espectroscópicos no polarizados mejorará la confiabilidad de los hallazgos particulares.

Además, la combinación de diferentes enfoques y tecnologías analíticos aún no establecidos en la práctica clínica aumentará la probabilidad de detectar cambios menores dentro de las características espectrales que reflejen las alteraciones conformacionales y de concentración de las moléculas relacionadas con HCC y/o sus metabolitos en el plasma sanguíneo. Hasta donde sabemos, nuestro laboratorio en el Departamento de Química Analítica de UCT Praga es el único en el mundo que tiene todas estas técnicas disponibles, y al mismo tiempo tiene una experiencia a largo plazo con el análisis de biofluidos. Todo el equipo utilizado para los análisis está disponible comercialmente y, por lo tanto; pueden ser comprados por laboratorios clínicos.