Nye molekylære spektrometriske biomarkører i blodplasma som et tidlig diagnostisk verktøy i HCC

Emner: Pasientrekruttering vil bli utført ved avdelingen for gastroenterologi, hepatologi og stoffskifte ved den interne klinikken ved det første medisinske fakultetet ved Karlsuniversitetet og det militære universitetssykehuset i Praha (MUH Praha). Utvalget av utvalgsstørrelser er avklart nedenfor (underavsnitt Datainnsamling og statistisk analyse).

Gruppe A: ~100 pasienter med levercirrhose med HCC-diagnosen bekreftet i henhold til standard diagnostiske kriterier publisert nylig av European Association for the Study of the Lever (EASL). Pasienter i alle HCC-stadier i henhold til Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC), i vår avdeling ~40-50 pasienter per år, vil bli inkludert.

Gruppe B: ~100 pasienter med levercirrhose uten HCC eller dysplastiske knuter ved undersøkelsestidspunktet og innen de neste 12 månedene etter oppfølging. Pasientene vil bli overvåket ved regelmessige kliniske besøk med generelle laboratorieundersøkelser og leverultralyd i 6-måneders intervaller (anbefalt overvåking for pasienter med levercirrhose med risiko for utvikling av HCC).

Gruppe C: ~50 friske frivillige uten levercirrhose (rekrutter fra den tsjekkiske hæren, aktivt militært personell fra den tsjekkiske hæren).

Rutinemessig undersøkt biokjemi (f.eks. totalt protein, albumin, alfa-fetoprotein, etc.) av alle studerte grupper vil bli korrelert med de nylig identifiserte spektroskopiske/metabolomiske biomarkørene. Et signert informert samtykke vil bli sikret fra hvert individ som er inkludert i studien (inkluderings-/eksklusjonskriterier oppført nedenfor). Plasmaforberedelse: Etter den allerede etablerte prosedyren for prøvetaking, klargjøring og analyse, vil hele blodet som er behandlet med antikoagulant (K3EDTA) fra alle forsøkspersoner samles ved venepunktur og sentrifugeres ved 1500 × g i 10 minutter. Plasmafraksjonene vil bli frosset umiddelbart (lagret ved -80 °C) og transportert til UCT Praha for spektroskopiske og metabolomiske analyser. Før hver analyse vil prøvene bli tint ved romtemperatur (~25 °C) og sentrifugert gjennom et 0,45 μm membranfilter ved 13 000 × g i 10 minutter. Deretter vil spektralmålingene bli utført (i tilfellet med ROA og Raman, vil en kinetisk fluorescensslukker bli lagt til for å undertrykke den spektralt brede bakgrunnen med stor amplitude, som overlapper signalene av interesse og er forårsaket av et høyt innhold av fluorescing molekyler i blodplasma).

Spektroskopisk analyse: For å oppfylle prosjektmålene vil etterforskerne benytte en unik kombinasjon av to kirotiske metoder - ECD og ROA - supplert med ikke-polariserte varianter - IR-absorpsjon og Raman-spektroskopi. Mens ECD oppdager absorpsjonsforskjellen mellom venstre og høyre sirkulært polarisert stråling, fungerer det kommersielt tilgjengelige spredte sirkulære polarisasjons-ROA-oppsettet med den lille intensitetsforskjellen mellom de sirkulært polariserte komponentene i det spredte lyset ved bruk av ikke-polarisert innfallende stråling. Begge disse metodene viser iboende følsomhet for 3D-strukturen og konformasjonen til flere kirale biomolekyler, som peptider, proteiner, sakkarider, nukleinsyrer og andre (20). Noen av disse typene forbindelser kan være blant de hvis 3D-struktur eller konsentrasjon i blodplasma varierer under utvikling av HCC. Mens ECD sensitivt reflekterer den generelle konformasjonen til kirale molekyler, fokuserer ROA på spesielle bindingstyper; og reflekterer dermed heller de strukturelle detaljene. I tillegg til peptid-ryggradsbåndene fra vanlige sekundære strukturelementer, spesifikt helikser og beta-ark, inneholder ROA-spektrene distinkte bånd fra løkker og svinger, og som sådan; de gir informasjon om tertiærstrukturen. Derfor vil samtidig bruk av ECD, ROA og de ikke-polariserte spektroskopiske metodene øke påliteligheten til de spesielle funnene.

Dessuten vil kombinasjon av forskjellige analytiske tilnærminger og teknologier som ennå ikke er etablert i klinisk praksis øke sannsynligheten for å oppdage mindre endringer i de spektrale funksjonene som gjenspeiler konformasjons- og konsentrasjonsendringene til de HCC-relaterte molekylene og/eller deres metabolitter i blodplasma. Så vidt vi vet er laboratoriet vårt ved Institutt for analytisk kjemi, UCT Praha det eneste i verden som har alle disse teknikkene tilgjengelig, samtidig som de har lang erfaring med biofluidanalyse. Alt utstyr som brukes til analysene er kommersielt tilgjengelig og dermed; kan kjøpes av kliniske laboratorier.