Charakterizace nových kandidátských genů v případech lidské dědičné trombocytopenie (CATCH) (CATCH)

Cirkulující krevní destičky jsou nezbytné pro udržení vaskulární integrity a funkčnosti v řadě patofyziologických situací, jako je kontrola hemoragických nebo trombotických příhod. Krevní destičky jsou uvolňovány do oběhu z vysoce specializovaných buněk kostní dřeně, megakaryocytů (MK), které procházejí složitým procesem diferenciace a zrání. Tento proces začíná diferenciací hematopoetických progenitorových buněk kostní dřeně (HPC) na zvětšující se, polyploidní nezralé MK, které se vyvinou v obří buňky umístěné na mikrovaskulatuře kostní dřeně a nakonec uvolňují do krevního řečiště fragmenty jejich cytoplazmy, které tvoří cirkulující krevní destičky. Tento konečný krok zrání MK se nazývá trombopoéza. V celém procesu, a zejména v přesném definování jak velikosti, tak počtu cirkulujících krevních destiček, se podílí více genů. Konstituční trombocytopenie (CT) jsou vzácná hematologická onemocnění etiologicky heterogenní, charakterizovaná výrazně sníženým počtem cirkulujících krevních destiček. Ve většině případů je trombocytopenie doprovázena změnou velikosti buněk, která se velmi často projevuje jako zvýšený střední objem. Trombocytopenie je pro pacienta celoživotní stav, a když jsou cirkulující krevní destičky výrazně sníženy, může to vést ke hemoragickým příhodám různé závažnosti, které mohou vyžadovat urgentní zásah, jako je transfuze krevních produktů. V závislosti na genu, který je pozměněn, může být CT přítomno souběžně s jinými onemocněními krevních buněk, jako je myelodysplastický syndrom nebo leukémie, nebo dokonce s extrahematologickými syndromy, jako je nefropatie, hluchota atd. CT však může být obtížné diagnostikovat a obtížně odlišit od různých forem získané trombocytopenie, jako je idiopatická trombocytopenie nebo trombocytopenie vyvolaná léky. Konečná diagnóza pro CT je založena na molekulární diagnóze, která musí prokázat, že variantní gen a protein nesoucí identifikovanou mutaci (mutace) mění produkci krevních destiček a mají za následek klinické CT.

Poznatky o genetickém základu CT se neustále rozšiřují, přičemž dosud bylo identifikováno ~ 40 genů jako kauzálních v případech CT. Tato identifikace je založena na přísných kritériích, jako je (1) bioinformatické hodnocení patogenity mutací, (2) asociace genotyp - fenotyp v informativních CT rodinách a (3) reprodukce molekulárních a buněčných abnormalit zaznamenaných u pacientů. pomocí experimentálních buněčných nebo zvířecích modelů. Všechny implikované geny a proteiny působí v důležitých krocích během diferenciace/maturace MK a zejména během trombopoézy. Kromě důležitých biomedicínských výsledků je nenahraditelným zdrojem objevů v základní buněčné biologii také charakterizace mutací těchto genů a jejich dopad na různé biologické procesy. U přibližně poloviny klinicky suspektních případů CT však genomická analýza známých implikovaných genů neobjeví variantu v jednom z těchto genů. Některé etiologie CT jsou tedy dosud neznámé a je třeba provést ještě mnoho výzkumů, aby se rozšířil a doplnil seznam genů a mutací zapojených do CT. To je důležité pro pacienty a rodiny, protože zajištění diagnózy CT zabrání chybné diagnóze a jejím potenciálním neefektivním nebo škodlivým terapeutickým intervencím, včetně transfuze krevních produktů, pokud to není relevantní, a zároveň umožní návrh přizpůsobeného léčebného/preventivního lékařského opatření, zejména když CT je spojeno s extradestičkovým nebo extrahematologickým syndromem.

V Resource and Competence Center for Constitutional Hemorrhagic Diseases (CRCMHC; Univerzitní nemocnice Robert Debré, Paříž, Francie) vytvořil vyšetřující tým kohortu více než 650 subjektů s CT, z nichž jen asi polovina obdržela genetickou diagnózu. Mezi pacienty bez takové molekulární diagnózy bylo nedávno vyšetřujícím týmem vyšetřeno několik nepříbuzných pacientů s familiární formou trombocytopenie a bylo prokázáno, že mají varianty genů, které dosud nebyly popsány jako formálně zapojené do výskytu CT. Klinický a molekulárně genetický důkaz však musí být doplněn funkčními studiemi odpovídajících variantních proteinů v jejich buněčném prostředí a tento experimentální, buněčný biologický přístup k patologii CT tvoří základ této klinické studie. Takové funkční studie budou zahrnovat:

• hodnocení toho, jak se krevní HPC získané od pacientů a rodinných příslušníků buď s CT nebo bez onemocnění (druhé jsou považovány za normální kontrolní subjekty), diferencují na MK, když jsou vysety do kultivačních misek, a pak dozrávají na MK tvořící protrombocyty, které jsou podobné rané krevní destičky vzniklé v kostní dřeni před jejich uvolněním do krve. Účelem je pozorovat a analyzovat jakoukoli morfologickou abnormalitu a abnormalitu proteinové exprese, která může být přítomna v CT buňkách a nepřítomná v non-CT buňkách. Používanými technikami jsou buněčná kultura, mikroskopické pozorování a analýza, jak kvalitativní, tak kvantitativní, modifikací v expresi proteinu a/nebo distribuce v buňkách, za použití sond, jako jsou protilátky vytvořené proti proteinům zájmu;
• hodnocení funkcí krevních destiček, jako je jejich schopnost přilnout k povrchu krevní cévy, poté agregovat, což je charakteristickým znakem jejich zásadní role při zastavování krvácení a stahování sraženiny, což je charakteristické pro jejich roli při utěsnění poškozené krevní cévu, čímž se vyhnete infekcím a připravíte tkáň na opravu. Cílem je zde pozorovat a analyzovat jakoukoli alteraci těchto vysoce destičkových funkcí během hemostázy u CT destiček ve srovnání s normálními destičkami, protože určité geny ovlivňující tvorbu destiček v kostní dřeni mohou hrát roli i ve funkcích destiček v oběhu. Používané techniky jsou mikroskopické zobrazování adherence destiček k experimentálním povrchům potaženým proteinem nebo ke skutečnému vaskulárnímu materiálu;
• hodnocení ultrastruktury a biochemie MK/destičky se zaměřením na intracelulární molekulární dráhy, na kterých se podílí variantní protein. Techniky pro tento účel jsou konfokální nebo elektronická mikroskopie, extrakce proteinů, purifikace a analýza.

Tyto experimentální studie se provádějí ve výzkumné laboratoři Národního institutu pro zdraví a lékařský výzkum (Inserm), "Inovativní terapie hemostázy (IThEM)" (Farmaceutická fakulta - Univerzita v Paříži, Paříž, Francie). Laboratoř v tomto klinickém hodnocení spolupracuje na základě spolupráce s CRCMHC, který působí proti proudu pro lékařskou, klinickou a genetickou charakterizaci pacientů a rodinných příslušníků, kteří mohou být poté požádáni o zařazení do studie. Laboratoř IThEM má také odborné znalosti pro vytváření buněčných modelů pro studium jednoho konkrétního genu a varianty proteinu, které lze experimentálně zavést do laboratorních lidských primárních buněk nebo buněčných linií za účelem reprodukce biologických změn původně pozorovaných v buňkách pacientů s CT. . To slouží k posílení důkazu, že variantní gen je skutečně patogenní, ale tato část studie je mimo současnou klinickou studii, protože nevyžaduje přístup k biologickému materiálu od pacientů a rodinných příslušníků, aby mohla být provedena.

Celkově je tato klinická studie zaměřena na přesné vymezení mechanismu účinku na molekulární a buněčné úrovni nově identifikovaných CT-asociovaných genových variant s cílem potvrdit nebo naopak vyvrátit patogenitu variantního genu. Splní několik cílů, (1) nabídnout pacientovi (pacientům) formální molekulární diagnostiku CT, (2) upřesnit a objasnit fenotypovou prezentaci formy CT generované touto variantou, (3) pomoci zlepšit lékařskou podporu pacientů, jak pro diagnostiku, tak pro terapii, zejména pokud má CT extra-trombocytární a/nebo extrahematologické protějšky, (4) poskytnout pacientům a rodinným příslušníkům příslušné genetické poradenství a (5) rozšířit ověřený panel geny implikované v CT a které mají být prozkoumány při prezentaci nového suspektního případu CT. Pomůže také v rozšíření základních znalostí o procesu megakaryocytopoézy a trombopoézy, a to jak normálních, tak patologických.