Caratterizzazione di nuovi geni candidati nei casi di trombocitopenia ereditaria umana (CATCH) (CATCH)

Le piastrine circolanti sono essenziali per il mantenimento dell'integrità e della funzionalità vascolare in numerose situazioni fisiopatologiche, come il controllo di eventi emorragici o trombotici. Le piastrine vengono rilasciate in circolo da cellule del midollo osseo altamente specializzate, i megacariociti (MK), che subiscono un complesso processo di differenziazione e maturazione. Questo processo inizia con la differenziazione delle cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) del midollo osseo in MK immaturi poliploidi ingranditi che si evolvono in cellule giganti apposte sulla microvascolarizzazione del midollo osseo e infine rilasciano nel flusso sanguigno frammenti del loro citoplasma che formano le piastrine circolanti. Questa fase finale della maturazione MK è chiamata trombopoiesi. Più geni sono implicati nell'intero processo, e in particolare nella definizione precisa sia della dimensione che del numero delle piastrine circolanti. Le trombocitopenie costitutive (CT) sono rare malattie ematologiche eziologicamente eterogenee, caratterizzate da una marcata diminuzione del numero di piastrine circolanti. Nella maggior parte dei casi, la trombocitopenia è accompagnata da un cambiamento nelle dimensioni delle cellule che molto spesso si manifesta come un aumento del volume medio. La trombocitopenia è uno stato permanente per il paziente e quando le piastrine circolanti sono fortemente diminuite, ciò può portare a eventi emorragici di gravità variabile che possono richiedere un intervento urgente come la trasfusione di emoderivati. A seconda del gene alterato, la CT può essere presente in parallelo con altre malattie delle cellule del sangue, come la sindrome mielodisplastica o la leucemia, o anche con sindromi extra-ematologiche, come la nefropatia, la sordità, ecc. Tuttavia, la TC può essere difficile da diagnosticare e difficile da differenziare da varie forme di trombocitopenia acquisita, come la trombocitopenia idiopatica o indotta da farmaci. La diagnosi definitiva per la CT si basa sulla diagnosi molecolare che deve dimostrare che una variante del gene e della proteina che ospitano una o più mutazioni identificate alterano la produzione piastrinica e determinano una CT clinica.

La conoscenza delle basi genetiche della CT è in continua espansione, con ~ 40 geni finora identificati come causali nei casi di CT. Questa identificazione si basa su criteri rigorosi come (1) valutazione basata sulla bioinformatica della patogenicità delle mutazioni, (2) associazione genotipo - fenotipo nelle famiglie CT informative e (3) riproduzione delle anomalie molecolari e cellulari osservate nei pazienti utilizzando modelli sperimentali cellulari o animali. Tutti i geni e le proteine ​​​​implicati agiscono in fasi importanti durante la differenziazione / maturazione MK, e in particolare durante la trombopoiesi. Oltre agli importanti risultati biomedici, la caratterizzazione delle mutazioni di questi geni e l'impatto che hanno su vari processi biologici è anche una fonte insostituibile di scoperte nella biologia cellulare di base. Tuttavia, in circa la metà dei casi di CT sospettati clinicamente, l'analisi genomica dei geni implicati noti non recupera una variante in uno di questi geni. Pertanto, alcune eziologie della CT sono ancora sconosciute e c'è ancora molta ricerca da svolgere per espandere e integrare l'elenco dei geni e delle mutazioni implicate nella CT. Questo è importante per i pazienti e le famiglie, perché assicurare la diagnosi di CT eviterà diagnosi errate e i suoi potenziali interventi terapeutici inefficienti o deleteri, inclusa la trasfusione di emoderivati ​​quando non pertinente, consentendo al tempo stesso di proporre un'azione medica curativa/preventiva adeguata, specialmente quando la TC è associata a una sindrome extrapiastrinica o extraematologica.

Presso il Resource and Competence Center for Constitutional Hemorrhagic Diseases (CRCMHC; University Hospital Robert Debré, Parigi, Francia), il team investigativo ha costruito una coorte di oltre 650 soggetti che si presentano con CT, di cui solo circa la metà ha ricevuto una diagnosi genetica. Tra i pazienti senza tale diagnosi molecolare, diversi pazienti non imparentati con una forma familiare di trombocitopenia sono stati recentemente studiati dal team investigativo e hanno dimostrato di ospitare varianti di geni non ancora descritti come formalmente implicati nell'insorgenza di CT. Tuttavia, le prove genetiche cliniche e molecolari devono essere completate da studi funzionali delle corrispondenti proteine ​​​​varianti nel loro ambiente cellulare, e questo approccio sperimentale di biologia cellulare della patologia CT costituisce la base del presente studio clinico. Tali studi funzionali includeranno:

• una valutazione di come le HPC ematiche ottenute da pazienti e familiari con CT o esenti dalla malattia (questi ultimi presi come normali soggetti di controllo), si differenziano in MK quando seminate in piastre di coltura, quindi maturano in MK formando propiastrine, che sono simili a le prime piastrine si sono formate nel midollo osseo prima del loro rilascio nel sangue. Lo scopo è quello di osservare e analizzare eventuali anomalie morfologiche e di espressione proteica che possono essere presenti nelle cellule CT e assenti nelle cellule non CT. Le tecniche utilizzate sono la coltura cellulare, l'osservazione al microscopio e l'analisi, sia qualitativa che quantitativa, delle modificazioni nell'espressione proteica e/o nella distribuzione nelle cellule, utilizzando sonde quali anticorpi sollevati contro le proteine ​​di interesse;
• una valutazione delle funzionalità piastriniche, come la loro capacità di aderire alla superficie di un vaso sanguigno, quindi di aggregarsi, un segno distintivo del loro ruolo essenziale nell'arresto del sanguinamento, e di ritrarre un coagulo, caratteristica del loro ruolo nella sigillatura di un danno vaso sanguigno, evitando così le infezioni e preparando il tessuto per la riparazione. Lo scopo qui è osservare e analizzare qualsiasi alterazione di queste funzioni altamente piastriniche durante l'emostasi nelle piastrine CT rispetto alle piastrine normali, perché alcuni geni che influenzano la produzione piastrinica nel midollo osseo possono anche svolgere un ruolo nelle funzioni delle piastrine circolanti. Le tecniche da utilizzare sono l'imaging microscopico dell'aderenza piastrinica a superfici rivestite di proteine ​​sperimentali oa materiale vascolare genuino;
• una valutazione dell'ultrastruttura e della biochimica di MK/piastrine, concentrandosi sui percorsi molecolari intracellulari in cui è implicata la proteina variante. Le tecniche da utilizzare a questo scopo sono la microscopia confocale o elettronica, l'estrazione delle proteine, la purificazione e l'analisi.

Questi studi sperimentali sono condotti in un laboratorio di ricerca dell'Istituto Nazionale per la Salute e la Ricerca Medica (Inserm), "Terapie innovative nell'emostasi (IThEM)" (Facoltà di Farmacia - Università di Parigi, Parigi, Francia). Il laboratorio sta agendo in questa sperimentazione clinica in collaborazione con il CRCMHC, che opera a monte per la caratterizzazione medica, clinica e genetica dei pazienti e dei familiari a cui potrebbe essere poi richiesta l'arruolamento nella sperimentazione. Il laboratorio IThEM ha anche l'esperienza per generare modelli cellulari per lo studio di una particolare variante genica e proteica, che può essere introdotta sperimentalmente in cellule primarie o linee cellulari umane di laboratorio al fine di riprodurre le alterazioni biologiche originariamente osservate nelle cellule dei pazienti CT . Ciò serve a rafforzare la dimostrazione che il gene variante è veramente patogeno, ma questa parte dello studio è al di fuori dell'attuale sperimentazione clinica perché non richiede l'accesso al materiale biologico dei pazienti e dei familiari per essere eseguita.

Nel complesso, questo studio clinico ha lo scopo di delineare con precisione il meccanismo d'azione a livello molecolare e cellulare delle varianti geniche associate alla CT recentemente identificate, al fine di confermare o, al contrario, invalidare la patogenicità del gene della variante. Raggiungerà diversi obiettivi, (1) offrire ai pazienti una diagnosi molecolare formale di CT, (2) precisare e chiarire la presentazione fenotipica della forma di CT generata da questa variante, (3) aiutare a migliorare supporto medico dei pazienti, sia per la diagnosi che per la terapia, in particolare se le CT hanno controparti extra-piastriniche e/o extra-ematologiche, (4) per fornire ai pazienti e ai familiari una consulenza genetica pertinente, e (5) per ampliare il panel validato di geni implicati nella TC e da esplorare alla presentazione di un nuovo caso sospetto di TC. Aiuterà anche ad estendere le conoscenze di base del processo di megacariocitopoiesi e trombopoiesi, sia normali che patologiche.