Charakterystyka nowych genów kandydujących w przypadkach małopłytkowości odziedziczonej u ludzi (CATCH) (CATCH)

Krążące płytki krwi są niezbędne do utrzymania integralności i funkcjonalności naczyń w wielu sytuacjach patofizjologicznych, takich jak kontrola zdarzeń krwotocznych lub zakrzepowych. Płytki krwi są uwalniane do krążenia z wysoce wyspecjalizowanych komórek szpiku kostnego, megakariocytów (MK), które przechodzą złożony proces różnicowania i dojrzewania. Proces ten rozpoczyna się od różnicowania hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) szpiku kostnego w powiększające się, poliploidalne niedojrzałe MK, które ewoluują w olbrzymie komórki przylegające do mikrokrążenia szpiku kostnego i ostatecznie uwalniają do krwioobiegu fragmenty ich cytoplazmy, które tworzą krążące płytki krwi. Ten ostateczny etap dojrzewania MK nazywa się trombopoezą. Wiele genów bierze udział w całym procesie, a zwłaszcza w precyzyjnym określaniu zarówno rozmiaru, jak i liczby krążących płytek krwi. Małopłytkowość konstytutywna (TK) to rzadkie choroby hematologiczne o niejednorodnej etiologii, charakteryzujące się znacznie zmniejszoną liczbą krążących płytek krwi. W większości przypadków trombocytopenii towarzyszy zmiana wielkości komórek, która bardzo często objawia się zwiększeniem średniej objętości. Małopłytkowość jest stanem trwającym całe życie pacjenta, a gdy liczba płytek krwi jest znacznie zmniejszona, może to prowadzić do krwotoków o różnym nasileniu, które mogą wymagać pilnej interwencji, takiej jak transfuzja produktów krwiopochodnych. W zależności od zmienionego genu, CT może występować równolegle z innymi chorobami komórek krwi, takimi jak zespół mielodysplastyczny lub białaczka, a nawet z zespołami pozahematologicznymi, takimi jak nefropatia, głuchota itp. Jednak tomografia komputerowa może być trudna do zdiagnozowania i trudna do odróżnienia od różnych form małopłytkowości nabytej, takich jak małopłytkowość idiopatyczna lub polekowa. Ostateczna diagnoza CT opiera się na diagnostyce molekularnej, która musi wykazać, że wariant genu i białka niosący zidentyfikowane mutacje zmieniają produkcję płytek krwi i prowadzą do klinicznej CT.

Wiedza na temat genetycznych podstaw CT stale się poszerza, przy czym do tej pory zidentyfikowano około 40 genów odpowiedzialnych za przypadki CT. Ta identyfikacja opiera się na rygorystycznych kryteriach, takich jak (1) oparta na bioinformatyce ocena patogenności mutacji, (2) powiązanie genotypu z fenotypem w informacyjnych rodzinach CT oraz (3) odtworzenie nieprawidłowości molekularnych i komórkowych stwierdzonych u pacjentów przy użyciu eksperymentalnych modeli komórkowych lub zwierzęcych. Wszystkie zaangażowane geny i białka działają na ważnych etapach podczas różnicowania / dojrzewania MK, a zwłaszcza podczas trombopoezy. Poza ważnymi wynikami biomedycznymi, charakterystyka mutacji tych genów i ich wpływu na różne procesy biologiczne jest również niezastąpionym źródłem odkryć z zakresu podstawowej biologii komórki. Jednak w około połowie klinicznie podejrzewanych przypadków CT analiza genomowa znanych genów zaangażowanych nie pozwala na odzyskanie wariantu w jednym z tych genów. Tak więc niektóre etiologie CT są jeszcze nieznane i wciąż pozostaje wiele badań do przeprowadzenia w celu poszerzenia i uzupełnienia listy genów i mutacji związanych z CT. Jest to ważne dla pacjentów i ich rodzin, ponieważ zapewnienie rozpoznania tomografii komputerowej pozwoli uniknąć błędnej diagnozy i potencjalnie nieskutecznych lub szkodliwych interwencji terapeutycznych, w tym transfuzji produktów krwiopochodnych, gdy nie jest to istotne, jednocześnie umożliwiając zaproponowanie dostosowanego działania leczniczego/zapobiegawczego, zwłaszcza gdy CT jest związane z zespołem pozapłytkowym lub pozahematologicznym.

W Centrum Zasobów i Kompetencji ds. Konstytucyjnych Chorób Krwotocznych (CRCMHC; Szpital Uniwersytecki im. Roberta Debré, Paryż, Francja) zespół badawczy stworzył kohortę ponad 650 pacjentów z tomografią komputerową, z których tylko około połowa otrzymała diagnozę genetyczną. Wśród pacjentów bez takiej diagnozy molekularnej zespół badawczy zbadał ostatnio kilku niespokrewnionych pacjentów z rodzinną postacią małopłytkowości i wykazano, że zawierają warianty genów, które nie zostały jeszcze opisane jako formalnie zaangażowane w występowanie CT. Jednak kliniczne i molekularne dowody genetyczne muszą być uzupełnione badaniami funkcjonalnymi odpowiednich wariantów białek w ich środowisku komórkowym, a to eksperymentalne podejście do biologii komórkowej patologii CT stanowi podstawę niniejszego badania klinicznego. Takie badania funkcjonalne będą obejmować:

• ocena, w jaki sposób HPC krwi pobranej od pacjentów i członków rodziny, zarówno z CT, jak i wolnych od choroby (tych ostatnich jako normalnych osobników kontrolnych), różnicuje się w MK po wysianiu w szalkach hodowlanych, a następnie dojrzewa w MK tworzących propłytki, które są podobne do wczesne płytki krwi powstające w szpiku kostnym przed ich uwolnieniem do krwi. Celem jest obserwacja i analiza wszelkich nieprawidłowości morfologicznych i ekspresji białek, które mogą być obecne w komórkach CT i nieobecne w komórkach innych niż CT. Stosowane techniki obejmują hodowlę komórkową, obserwację mikroskopową i analizę, zarówno jakościową, jak i ilościową, modyfikacji ekspresji i/lub dystrybucji białek w komórkach, przy użyciu sond, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko badanym białkom;
• ocena funkcji płytek krwi, takich jak ich zdolność przylegania do powierzchni naczynia krwionośnego, a następnie agregacji, cecha charakterystyczna ich zasadniczej roli w zatrzymywaniu krwawienia i cofaniu skrzepu, charakterystyczna dla ich roli w uszczelnianiu uszkodzonego naczynia krwionośnego naczynia krwionośne, unikając w ten sposób infekcji i przygotowując tkankę do naprawy. Celem jest obserwacja i analiza wszelkich zmian tych wysoce swoistych dla płytek krwi funkcji podczas hemostazy w płytkach CT w porównaniu z prawidłowymi płytkami krwi, ponieważ pewne geny wpływające na produkcję płytek krwi w szpiku kostnym mogą również odgrywać rolę w funkcjach krążących płytek krwi. Techniki, które należy zastosować, to obrazowanie mikroskopowe przylegania płytek krwi do eksperymentalnych powierzchni pokrytych białkiem lub do prawdziwego materiału naczyniowego;
• ocena ultrastruktury i biochemii MK/płytek krwi, ze szczególnym uwzględnieniem wewnątrzkomórkowych szlaków molekularnych, w które zaangażowany jest wariant białka. Techniki stosowane w tym celu to mikroskopia konfokalna lub elektroniczna, ekstrakcja białek, oczyszczanie i analiza.

Te badania eksperymentalne są prowadzone w laboratorium badawczym Narodowego Instytutu Zdrowia i Badań Medycznych (Inserm), „Innowacyjne terapie w hemostazie (IThEM)” (Wydział Farmacji - Uniwersytet Paryski, Paryż, Francja). Laboratorium działa w tym badaniu klinicznym na zasadzie współpracy z CRCMHC, które działa na wyższym szczeblu w celu medycznej, klinicznej i genetycznej charakterystyki pacjentów i członków ich rodzin, którzy mogą zostać następnie poproszeni o włączenie do badania. Laboratorium IThEM posiada również wiedzę specjalistyczną w zakresie generowania modeli komórkowych do badania jednego konkretnego wariantu genu i białka, które można eksperymentalnie wprowadzić do laboratoryjnych ludzkich komórek pierwotnych lub linii komórkowych w celu odtworzenia zmian biologicznych pierwotnie zaobserwowanych w komórkach pochodzących od pacjentów z tomografii komputerowej . Służy to wzmocnieniu wykazania, że ​​wariant genu jest naprawdę patogenny, ale ta część badania jest poza obecnym badaniem klinicznym, ponieważ nie wymaga dostępu do materiału biologicznego od pacjentów i członków rodziny w celu wykonania.

Ogólnie rzecz biorąc, to badanie kliniczne ma na celu precyzyjne określenie mechanizmu działania na poziomie molekularnym i komórkowym nowo zidentyfikowanych wariantów genów związanych z CT, w celu potwierdzenia lub odwrotnie, unieważnienia patogenności wariantu genu. Spełni kilka celów: (1) zaoferować pacjentowi (pacjentom) formalną diagnostykę molekularną CT, (2) sprecyzować i wyjaśnić fenotypową prezentację postaci CT generowanej przez ten wariant, (3) pomóc w złagodzeniu wsparcie medyczne pacjentów, zarówno w diagnostyce, jak i terapii, zwłaszcza jeśli tomografia komputerowa ma odpowiedniki pozapłytkowe i/lub pozahematologiczne, (4) zapewnienie pacjentom i członkom ich rodzin odpowiedniego poradnictwa genetycznego oraz (5) poszerzenie zwalidowanego panelu geny zaangażowane w CT i do zbadania po przedstawieniu nowego podejrzanego przypadku CT. Pomoże również w poszerzeniu podstawowej wiedzy na temat procesu megakariocytopoezy i trombopoezy, zarówno prawidłowej, jak i patologicznej.