Karakterisering av nye kandidatgener i tilfeller av menneskelig arvelig trombocytopeni (CATCH) (CATCH)

Sirkulerende blodplater er avgjørende for å opprettholde vaskulær integritet og funksjonalitet i en rekke patofysiologiske situasjoner, for eksempel kontroll av hemoragiske eller trombotiske hendelser. Blodplater frigjøres til sirkulasjonen fra høyt spesialiserte benmargsceller, megakaryocyttene (MKs) som gjennomgår en kompleks prosess med differensiering og modning. Denne prosessen starter med differensieringen av benmargshematopoietiske stamceller (HPC) til forstørrende, polyploide umodne MK-er som utvikler seg til gigantiske celler plassert på benmargsmikrovaskulaturen, og til slutt frigjør fragmenter av deres cytoplasma i blodstrømmen som lager de sirkulerende blodplatene. Dette ultimate trinnet i MK-modning kalles trombopoiesis. Flere gener er involvert i hele prosessen, og spesielt i nøyaktig definering av både størrelsen og antallet av sirkulerende blodplater. Konstitutiv trombocytopeni (CT) er sjeldne hematologiske sykdommer etiologisk heterogene, karakterisert ved et markant redusert antall sirkulerende blodplater. I de fleste tilfellene er trombocytopeni ledsaget av en endring i cellestørrelse som svært ofte vises som et økt gjennomsnittlig volum. Trombocytopeni er en livslang status for pasienten, og når sirkulerende blodplater er sterkt redusert, kan dette føre til blødningshendelser av varierende alvorlighetsgrad som kan kreve akutt intervensjon som transfusjon av blodprodukter. Avhengig av genet som er endret, kan CT være tilstede parallelt med andre blodcellesykdommer, slik som myelodysplastisk syndrom eller leukemi, eller til og med med ekstrahematologiske syndromer, slik som nefropati, døvhet, etc. CT kan imidlertid være vanskelig å diagnostisere og vanskelig å skille fra ulike former for ervervet trombocytopeni, som idiopatisk eller medikamentindusert trombocytopeni. Den endelige diagnosen for CT er basert på den molekylære diagnosen som må vise at et variantgen og protein som inneholder identifiserte mutasjoner endrer blodplateproduksjonen og resulterer i klinisk CT.

Kunnskapen om det genetiske grunnlaget for CT utvides kontinuerlig, med ~40 gener identifisert så langt som forårsakende i CT-tilfeller. Denne identifiseringen er basert på strenge kriterier som (1) bioinformatikkbasert evaluering av patogenisiteten til mutasjonene, (2) genotype-fenotype-assosiasjon i informative CT-familier, og (3) reproduksjon av de molekylære og cellulære abnormitetene som er registrert hos pasientene. ved å bruke eksperimentelle cellulære eller dyremodeller. Alle impliserte gener og proteiner virker på viktige trinn under MK-differensiering/modning, og spesielt under trombopoiesis. I tillegg til viktige biomedisinske resultater er karakterisering av mutasjoner av disse genene og innvirkningen de har på ulike biologiske prosesser også en uerstattelig kilde til oppdagelser innen grunnleggende cellebiologi. Imidlertid, i omtrent halvparten av klinisk mistenkte CT-tilfeller, gjenoppretter ikke genomisk analyse av de kjente impliserte genene en variant i ett av disse genene. Dermed er noen etiologier av CT ennå ukjente, og det er fortsatt mye undersøkelse som skal utføres for å utvide og utfylle listen over gener og mutasjoner som er involvert i CT. Dette er viktig for pasientene og familiene, fordi forsikring av diagnosen CT vil unngå feildiagnostisering og dens potensielle ineffektive eller skadelige terapeutiske intervensjoner, inkludert blodprodukttransfusjon når det ikke er relevant, samtidig som det tillater et forslag om en tilpasset kurativ/forebyggende medisinsk handling, spesielt når CT er assosiert med et ekstra-blodplate- eller ekstrahematologisk syndrom.

Ved ressurs- og kompetansesenteret for konstitusjonelle hemorragiske sykdommer (CRCMHC; Universitetssykehuset Robert Debré, Paris, Frankrike), har etterforskningsteamet bygget en kohort med mer enn 650 forsøkspersoner som har CT, som bare omtrent halvparten har fått en genetisk diagnose. Blant pasientene uten en slik molekylær diagnose har flere, ubeslektede pasienter med en familiær form for trombocytopeni nylig blitt undersøkt av undersøkelsesteamet og vist å inneholde varianter av gener som ennå ikke er beskrevet som formelt involvert i forekomsten av CT. Imidlertid må kliniske og molekylærgenetiske bevis fullføres av funksjonelle studier av de tilsvarende variantproteinene i deres cellulære miljø, og denne eksperimentelle, cellebiologiske tilnærmingen til CT-patologien danner grunnlaget for denne kliniske studien. Slike funksjonelle studier vil omfatte:

• en evaluering av hvordan blod HPC oppnådd fra pasienter og familiemedlemmer enten med CT eller fritt for sykdommen (sistnevnte tatt som normale kontrollpersoner), differensierer til MKs når de sås ut i kulturskåler, og modnes til MKs som danner proplatelets, som ligner på de tidlige blodplatene dannet i benmargen før de ble frigjort til blod. Hensikten er å observere og analysere eventuelle morfologiske og proteinekspresjonsavvik som kan være tilstede i CT-celler, og fraværende i ikke-CT-celler. Teknikkene som brukes er cellekultur, mikroskopobservasjon og analyse, både kvalitativ og kvantitativ, av modifikasjoner i proteinekspresjon og/eller distribusjon i celler, ved bruk av prober som antistoffer reist mot proteinene av interesse;
• en evaluering av blodplatefunksjoner, slik som deres evne til å feste seg til overflaten av en blodåre, for deretter å samle seg, et kjennetegn på deres viktige rolle i å stoppe blødning, og å trekke tilbake en blodpropp, karakteristisk for deres rolle i forseglingen av en skadet blodåre, og dermed unngå infeksjoner og forberede vevet for reparasjon. Målet her er å observere og analysere enhver endring av disse svært blodplatespesifikke funksjonene under hemostase i CT-blodplater sammenlignet med normale blodplater, fordi visse gener som påvirker blodplateproduksjonen i benmargen også kan spille en rolle i funksjonene til sirkulerende blodplater. Teknikker som skal brukes er mikroskopi avbildning av blodplatevedheft til eksperimentelle proteinbelagte overflater, eller til ekte vaskulært materiale;
• en evaluering av MK/blodplate-ultrastrukturen og biokjemien, med fokus på de intracellulære molekylære banene variantproteinet er involvert i. Teknikker som skal brukes til dette formålet er konfokal eller elektronisk mikroskopi, proteinekstraksjon, rensing og analyse.

Disse eksperimentelle studiene er utført i et forskningslaboratorium fra National Institute for Health and Medical Research (Inserm), "Innovative Therapies in Haemostasis (IThEM)" (Fakultet for farmasi - Universitetet i Paris, Paris, Frankrike). Laboratoriet handler i denne kliniske utprøvingen på samarbeidsbasis med CRCMHC, som opererer oppstrøms for medisinsk, klinisk og genetisk karakterisering av pasienter og familiemedlemmer som deretter kan bli bedt om å delta i studien. IThEM-laboratoriet har også ekspertisen til å generere cellulære modeller for studiet av en bestemt gen- og proteinvariant, som eksperimentelt kan introduseres i humane primærceller eller cellelinjer i laboratoriet for å reprodusere de biologiske endringene som opprinnelig ble observert i celler fra CT-pasientene . Dette tjener til å styrke demonstrasjonen av at variantgenet virkelig er patogent, men denne delen av studien ligger utenfor den nåværende kliniske studien fordi den ikke krever tilgang til biologisk materiale fra pasientene og familiemedlemmer for å kunne utføres.

I det hele tatt er denne kliniske studien rettet mot å presist avgrense virkningsmekanismen på molekylære og cellulære nivåer av nylig identifiserte CT-assosierte genvarianter, for å bekrefte eller omvendt ugyldiggjøre patogenisiteten til variantgenet. Det vil oppfylle flere mål, (1) å tilby pasienten(e) en formell molekylær diagnose av CT, (2) å presisere og belyse den fenotypiske presentasjonen av formen for CT generert av denne varianten, (3) å bidra til å forbedre pasienters medisinske støtte, både for diagnose og terapi, spesielt hvis CT har ekstra blodplater og/eller ekstra hematologiske motstykker, (4) for å gi pasienter og familiemedlemmer en relevant genetisk rådgivning, og (5) for å utvide det validerte panelet med gener involvert i CT og skal utforskes ved presentasjon av et nytt mistenkt tilfelle av CT. Det vil også bidra til å utvide den grunnleggende kunnskapen om prosessen med megakaryocytopoiesis og trombopoiesis, både normal og patologisk.