Uusien kandidaattigeenien karakterisointi ihmisen periytyvän trombosytopenian (CATCH) tapauksissa (CATCH)

Verihiutaleet ovat välttämättömiä verisuonten eheyden ja toimivuuden ylläpitämisessä lukuisissa patofysiologisissa tilanteissa, kuten verenvuoto- tai tromboottisten tapahtumien hallinnassa. Verihiutaleet vapautuvat verenkiertoon pitkälle erikoistuneista luuydinsoluista, megakaryosyyteistä (MK), jotka käyvät läpi monimutkaisen erilaistumis- ja kypsymisprosessin. Tämä prosessi alkaa luuytimen hematopoieettisten progenitorisolujen (HPC) erilaistumisesta laajentuviksi, polyploideiksi epäkypsiksi MK:iksi, jotka kehittyvät jättimäisiksi soluiksi, jotka ovat kiinnittyneet luuytimen mikroverisuonistoon, ja lopulta vapauttavat verenkiertoon niiden sytoplasman fragmentteja, jotka muodostavat kiertäviä verihiutaleita. Tätä MK:n kypsymisen viimeistä vaihetta kutsutaan trombopoieesiksi. Useat geenit ovat osallisena koko prosessissa ja erityisesti sekä kiertävien verihiutaleiden koon että lukumäärän tarkkaan määrittelyssä. Konstitutiivinen trombosytopenia (CT) ovat harvinaisia ​​hematologisia sairauksia, jotka ovat etiologisesti heterogeenisiä, ja niille on ominaista verenkierrossa olevien verihiutaleiden huomattava vähentyminen. Useimmissa tapauksissa trombosytopeniaan liittyy solukoon muutos, joka näkyy hyvin usein lisääntyneenä keskimääräisenä tilavuutena. Trombosytopenia on potilaan elinikäinen tila, ja kun kiertävät verihiutaleet ovat vähentyneet voimakkaasti, tämä voi johtaa vaihtelevan vaikeusasteen verenvuototapahtumiin, jotka saattavat vaatia kiireellistä toimenpiteitä, kuten verivalmisteiden siirtoa. Muunnetusta geenistä riippuen TT voi esiintyä rinnakkain muiden verisolusairauksien, kuten myelodysplastisen oireyhtymän tai leukemian, tai jopa ekstrahematologisten oireyhtymien, kuten nefropatian, kuurouden jne., kanssa. TT:tä voi kuitenkin olla vaikea diagnosoida ja vaikea erottaa hankitun trombosytopenian eri muodoista, kuten idiopaattisesta tai lääkkeiden aiheuttamasta trombosytopeniasta. Lopullinen TT-diagnoosi perustuu molekyylidiagnoosiin, jonka on osoitettava, että geenivariantti ja proteiini, jossa on tunnistettu mutaatio (mutaatioita), muuttavat verihiutaleiden tuotantoa ja johtavat kliiniseen TT:hen.

Tieto TT:n geneettisestä perustasta laajenee jatkuvasti, ja noin 40 geeniä on todettu tähän mennessä aiheuttaviksi TT-tapauksissa. Tämä tunnistaminen perustuu tiukoihin kriteereihin, kuten (1) bioinformatiikkaan perustuva mutaatioiden patogeenisuuden arviointi, (2) genotyyppi-fenotyyppiyhdistys informatiivisissa CT-perheissä ja (3) potilailla havaittujen molekyyli- ja solupoikkeavuuksien lisääntyminen. käyttämällä kokeellisia solu- tai eläinmalleja. Kaikki asiaan liittyvät geenit ja proteiinit toimivat tärkeissä vaiheissa MK:n erilaistumisen/kypsymisen aikana ja erityisesti trombopoieesin aikana. Tärkeiden biolääketieteellisten tulosten lisäksi näiden geenien mutaatioiden karakterisointi ja niiden vaikutus erilaisiin biologisiin prosesseihin on myös korvaamaton solubiologian löytöjen lähde. Noin puolessa kliinisesti epäillyistä CT-tapauksista tunnettujen asiaan liittyvien geenien genomianalyysi ei kuitenkaan löydä varianttia yhdessäkään näistä geeneistä. Näin ollen jotkin TT:n etiologiat ovat vielä tuntemattomia, ja TT:hen liittyvien geenien ja mutaatioiden luettelon laajentamiseksi ja täydentämiseksi on vielä tehtävä paljon tutkimuksia. Tämä on tärkeää potilaille ja perheille, koska TT-diagnoosin varmistaminen välttää virhediagnoosin ja sen mahdolliset tehottomat tai haitalliset terapeuttiset interventiot, mukaan lukien verituotteiden siirrot, jos ne eivät ole tarkoituksenmukaisia, ja mahdollistaa mukautetun parantavan/ehkäisevän lääketieteellisen toimenpiteen ehdotuksen, varsinkin kun TT liittyy ekstra-verihiutale- tai ekstra-hematologiseen oireyhtymään.

Perustuslaillisten verenvuototautien resurssi- ja osaamiskeskuksessa (CRCMHC; University Hospital Robert Debré, Pariisi, Ranska) tutkimusryhmä on rakentanut yli 650 TT:tä sairastavan kohortin, joista vain noin puolet on saanut geneettisen diagnoosin. Niiden potilaiden joukossa, joilla ei ole tällaista molekyylidiagnoosia, tutkimusryhmä on äskettäin tutkinut useita toisiinsa liittymättömiä potilaita, joilla on perinnöllinen trombosytopenia ja joiden on osoitettu sisältävän muunnelmia geeneistä, joita ei vielä ole kuvattu muodollisesti osallisiksi CT:n esiintymiseen. Kliiniset ja molekyyligeneettiset todisteet on kuitenkin täydennettävä toiminnallisilla tutkimuksilla vastaavista muunnosproteiineista niiden soluympäristössä, ja tämä kokeellinen, solubiologinen lähestymistapa CT-patologiaan muodostaa tämän kliinisen tutkimuksen perustan. Tällaisia ​​toiminnallisia tutkimuksia ovat mm.

• arvio siitä, kuinka veren HPC, joka on saatu potilailta ja perheenjäseniltä joko CT:llä tai taudista vapaana (jälkimmäinen otetaan normaaleina kontrollihenkilöinä), erilaistuu MK:iksi, kun ne kylvetään viljelymaljoille, ja kypsyvät sitten MK:iksi, jotka muodostavat propleetteja, jotka ovat samanlaisia ​​kuin varhaiset verihiutaleet muodostuivat luuytimessä ennen niiden vapautumista vereen. Tarkoituksena on tarkkailla ja analysoida kaikkia morfologisia ja proteiinien ilmentymisen poikkeavuuksia, joita saattaa esiintyä CT-soluissa ja puuttua ei-CT-soluissa. Käytetyt tekniikat ovat soluviljelmä, mikroskooppihavainnointi ja -analyysi, sekä kvalitatiivinen että kvantitatiivinen, proteiinien ilmentymisen ja/tai jakautumisen modifikaatioista soluissa käyttäen koettimia, kuten mielenkiinnon kohteena olevia proteiineja vastaan ​​tuotettuja vasta-aineita;
• verihiutaleiden toimintojen arviointi, kuten niiden kyky kiinnittyä verisuonen pintaan ja sitten aggregoitua, mikä on tunnusmerkki niiden keskeisestä roolista verenvuodon pysäyttämisessä ja vetäytyä takaisin, mikä on ominaista niiden roolille vaurioituneen suonen sulkemisessa verisuonia, jolloin vältetään infektiot ja valmistetaan kudos korjausta varten. Tarkoituksena on tarkkailla ja analysoida näiden erittäin verihiutalespesifisten toimintojen muutosta hemostaasin aikana TT-verihiutaleissa verrattuna normaaleihin verihiutaleisiin, koska tietyt verihiutaleiden tuotantoon vaikuttavat geenit luuytimessä voivat myös vaikuttaa kiertävien verihiutaleiden toiminnassa. Käytettävät tekniikat ovat mikroskooppikuvaus verihiutaleiden kiinnittymisestä kokeellisiin proteiinipäällysteisiin pintoihin tai aitoon verisuonimateriaaliin;
• MK/verihiutaleiden ultrarakenteen ja biokemian arviointi, jossa keskitytään solunsisäisiin molekyylireitteihin, joihin varianttiproteiini on osallisena. Tähän tarkoitukseen käytettäviä tekniikoita ovat konfokaalinen tai elektroninen mikroskopia, proteiinien uutto, puhdistus ja analyysi.

Nämä kokeelliset tutkimukset suoritetaan National Institute for Health and Medical Researchin (Inserm) tutkimuslaboratoriossa "Innovative Therapies in Haemostasis (IThEM)" (farmasian tiedekunta - Pariisin yliopisto, Pariisi, Ranska). Laboratorio toimii tässä kliinisessä tutkimuksessa yhteistyössä CRCMHC:n kanssa, joka toimii alkuvaiheessa potilaiden ja perheenjäsenten lääketieteellisessä, kliinisessä ja geneettisessä karakterisoinnissa, joita voidaan sitten pyytää osallistumaan tutkimukseen. IThEM-laboratoriolla on myös asiantuntemusta luoda solumalleja yhden tietyn geenin ja proteiinivariantin tutkimiseen, jotka voidaan kokeellisesti viedä ihmisen primaarisoluihin tai solulinjoihin TT-potilaiden soluissa alun perin havaittujen biologisten muutosten toistamiseksi. . Tämä vahvistaa osoitusta siitä, että varianttigeeni on todella patogeeninen, mutta tämä osa tutkimuksesta on tämän kliinisen tutkimuksen ulkopuolella, koska se ei vaadi pääsyä potilaiden ja perheenjäsenten biologiseen materiaaliin suorittaakseen.

Kaiken kaikkiaan tämän kliinisen tutkimuksen tarkoituksena on rajata tarkasti vastatunnistettujen CT:hen liittyvien geenivarianttien vaikutusmekanismi molekyyli- ja solutasoilla, jotta voidaan vahvistaa tai päinvastoin mitätöidä varianttigeenin patogeenisyys. Se täyttää useita tavoitteita, (1) tarjota potilaalle (potilaille) muodollinen CT:n molekyylidiagnoosi, (2) täsmentää ja selventää tämän muunnelman tuottaman TT:n muodon fenotyyppistä esitystä, (3) auttaa parantamaan potilaiden lääketieteellinen tuki sekä diagnoosissa että hoidossa, erityisesti jos TT:llä on verihiutaleiden ulkopuolisia ja/tai hematologisia vastineita, (4) potilaiden ja perheenjäsenten asianmukaista geneettistä neuvontaa ja (5) validoitua paneelia laajentamaan. geenit, jotka liittyvät CT:hen ja joita tutkitaan uuden epäillyn CT-tapauksen esittelyssä. Se auttaa myös laajentamaan perustietoa megakaryosytopoieesin ja trombopoieesin prosessista, sekä normaalista että patologisesta.