Karakterisering van nieuwe kandidaat-genen in gevallen van menselijke erfelijke trombocytopenie (CATCH) (CATCH)

Circulerende bloedplaatjes zijn essentieel voor het behoud van de vasculaire integriteit en functionaliteit in tal van pathofysiologische situaties, zoals de beheersing van hemorragische of trombotische voorvallen. Bloedplaatjes komen vrij in de circulatie vanuit zeer gespecialiseerde beenmergcellen, de megakaryocyten (MK's) die een complex proces van differentiatie en rijping ondergaan. Dit proces begint met de differentiatie van hematopoietische progenitorcellen (HPC) in het beenmerg tot vergrotende, polyploïde onrijpe MK's die evolueren tot gigantische cellen die zich op de microvasculatuur van het beenmerg bevinden en uiteindelijk fragmenten van hun cytoplasma in de bloedbaan vrijgeven die de circulerende bloedplaatjes vormen. Deze ultieme stap van MK-rijping wordt trombopoëse genoemd. Meerdere genen zijn betrokken bij het hele proces, en met name bij het nauwkeurig definiëren van zowel de grootte als het aantal circulerende bloedplaatjes. Constitutieve trombocytopenie (CT) is een zeldzame hematologische ziekte die etiologisch heterogeen is en wordt gekenmerkt door een duidelijk verminderd aantal circulerende bloedplaatjes. In de meeste gevallen gaat trombocytopenie gepaard met een verandering in de celgrootte die heel vaak verschijnt als een groter gemiddeld volume. Trombocytopenie is een levenslange status voor de patiënt, en wanneer circulerende bloedplaatjes sterk verminderd zijn, kan dit leiden tot hemorragische voorvallen van variabele ernst die een dringende interventie kunnen vereisen, zoals transfusie van bloedproducten. Afhankelijk van het gen dat is veranderd, kan CT parallel aanwezig zijn met andere bloedcelziekten, zoals myelodysplastisch syndroom of leukemie, of zelfs met extra-hematologische syndromen, zoals nefropathie, doofheid, enz. CT kan echter moeilijk te diagnosticeren zijn en moeilijk te onderscheiden van verschillende vormen van verworven trombocytopenie, zoals idiopathische of door geneesmiddelen geïnduceerde trombocytopenie. De uiteindelijke diagnose voor CT is gebaseerd op de moleculaire diagnose die moet aantonen dat een variant van het gen en eiwit met geïdentificeerde mutatie(s) de productie van bloedplaatjes verandert en resulteert in klinische CT.

Kennis over de genetische basis van CT wordt voortdurend uitgebreid, met ~ 40 genen die tot nu toe zijn geïdentificeerd als oorzakelijk in CT-gevallen. Deze identificatie is gebaseerd op strenge criteria zoals (1) op bio-informatica gebaseerde evaluatie van de pathogeniteit van de mutaties, (2) genotype-fenotype-associatie in informatieve CT-families, en (3) reproductie van de moleculaire en cellulaire afwijkingen die bij de patiënten zijn waargenomen. door gebruik te maken van experimentele cellulaire of diermodellen. Alle betrokken genen en eiwitten werken op belangrijke stappen tijdens MK-differentiatie / rijping, en in het bijzonder tijdens trombopoëse. Naast belangrijke biomedische resultaten, is de karakterisering van mutaties van deze genen en de impact die ze hebben op verschillende biologische processen ook een onvervangbare bron van ontdekkingen in de basiscelbiologie. In ongeveer de helft van de klinisch vermoede CT-gevallen kan genomische analyse van de bekende geïmpliceerde genen echter geen variant in een van deze genen herstellen. Sommige etiologieën van CT zijn dus nog onbekend, en er moet nog veel onderzoek worden gedaan om de lijst van genen en mutaties die betrokken zijn bij CT uit te breiden en aan te vullen. Dit is belangrijk voor de patiënten en families, omdat het verzekeren van de diagnose van CT een verkeerde diagnose en de mogelijke inefficiënte of schadelijke therapeutische interventies, inclusief bloedproducttransfusie wanneer niet relevant, voorkomt, terwijl een voorstel voor een aangepaste curatieve/preventieve medische actie mogelijk is, vooral wanneer de CT is geassocieerd met een extrabloedplaatjes- of extrahematologisch syndroom.

In het Resource and Competence Centre for Constitutional Hemorrhagic Diseases (CRCMHC; Universitair Ziekenhuis Robert Debré, Parijs, Frankrijk) heeft het onderzoeksteam een ​​cohort opgebouwd van meer dan 650 proefpersonen met CT, van wie slechts ongeveer de helft een genetische diagnose heeft gekregen. Onder de patiënten zonder een dergelijke moleculaire diagnose zijn onlangs verschillende, niet-verwante patiënten met een familiale vorm van trombocytopenie door het onderzoeksteam onderzocht en aangetoond dat ze varianten van genen bevatten waarvan nog niet is beschreven dat ze formeel betrokken zijn bij het optreden van CT. Klinisch en moleculair genetisch bewijs moet echter worden aangevuld door functionele studies van de overeenkomstige eiwitvarianten in hun cellulaire omgeving, en deze experimentele, celbiologische benadering van de CT-pathologie vormt de basis van de huidige klinische proef. Dergelijke functionele studies omvatten:

• een evaluatie van hoe bloed-HPC verkregen van patiënten en familieleden met CT of vrij van de ziekte (de laatste genomen als normale controlepersonen), differentiëren tot MK's wanneer ze in kweekschalen worden gezaaid, en vervolgens rijpen tot MK's die proplatelets vormen, die vergelijkbaar zijn met de vroege bloedplaatjes gevormd in het beenmerg voordat ze in het bloed vrijkomen. Het doel is het observeren en analyseren van elke morfologische en eiwitexpressie-afwijking die aanwezig kan zijn in CT-cellen en afwezig is in niet-CT-cellen. De gebruikte technieken zijn celkweek, microscoopobservatie en analyse, zowel kwalitatief als kwantitatief, van modificaties in eiwitexpressie en/of distributie in cellen, met behulp van sondes zoals antilichamen die zijn opgewekt tegen de eiwitten van belang;
• een evaluatie van de functies van bloedplaatjes, zoals hun vermogen om zich aan het oppervlak van een bloedvat te hechten en vervolgens te aggregeren, een kenmerk van hun essentiële rol bij het stoppen van bloedingen, en om een ​​stolsel terug te trekken, kenmerkend voor hun rol bij het afdichten van een beschadigd bloedvat bloedvat, waardoor infecties worden vermeden en het weefsel wordt voorbereid op herstel. Het doel hier is om elke verandering van deze zeer bloedplaatjesspecifieke functies tijdens hemostase in CT-bloedplaatjes te observeren en te analyseren in vergelijking met normale bloedplaatjes, omdat bepaalde genen die de bloedplaatjesproductie in het beenmerg beïnvloeden, ook een rol kunnen spelen bij de functies van circulerende bloedplaatjes. Te gebruiken technieken zijn microscopische beeldvorming van de hechting van bloedplaatjes aan experimentele met eiwit beklede oppervlakken of aan echt vasculair materiaal;
• een evaluatie van de ultrastructuur en biochemie van MK/bloedplaatjes, gericht op de intracellulaire moleculaire routes waarbij het variante eiwit betrokken is. Technieken die hiervoor gebruikt kunnen worden zijn confocale of elektronische microscopie, eiwitextractie, zuivering en analyse.

Deze experimentele onderzoeken worden uitgevoerd in een onderzoekslaboratorium van het National Institute for Health and Medical Research (Inserm), "Innovative Therapies in Haemostasis (IThEM)" (Faculteit Farmacie - Universiteit van Parijs, Parijs, Frankrijk). Het laboratorium handelt in deze klinische proef op basis van samenwerking met het CRCMHC, dat stroomopwaarts opereert voor de medische, klinische en genetische karakterisering van patiënten en familieleden die vervolgens kunnen worden gevraagd om deel te nemen aan de proef. Het IThEM-laboratorium heeft ook de expertise om cellulaire modellen te genereren voor de studie van één bepaalde gen- en eiwitvariant, die experimenteel kunnen worden geïntroduceerd in menselijke primaire laboratoriumcellen of cellijnen om de biologische veranderingen te reproduceren die oorspronkelijk werden waargenomen in cellen van de CT-patiënten. . Dit dient om de demonstratie te versterken dat het variantgen echt pathogeen is, maar dit deel van de studie valt buiten de huidige klinische proef omdat het geen toegang tot biologisch materiaal van de patiënten en familieleden vereist om te worden uitgevoerd.

In het algemeen is deze klinische studie bedoeld om het werkingsmechanisme op moleculair en cellulair niveau van nieuw geïdentificeerde CT-geassocieerde genvarianten nauwkeurig af te bakenen, om de pathogeniciteit van het variantgen te bevestigen of, omgekeerd, ongeldig te maken. Het zal verschillende doelstellingen vervullen, (1) de patiënt(en) een formele moleculaire diagnose van CT bieden, (2) de fenotypische presentatie van de vorm van CT die door deze variant wordt gegenereerd, nauwkeuriger en ophelderen, (3) helpen bij het verbeteren van medische ondersteuning van patiënten, zowel voor diagnose als therapie, in het bijzonder als CT extra-bloedplaatjes en / of extra-hematologische tegenhangers heeft, (4) om patiënten en familieleden relevante genetische counseling te bieden, en (5) om het gevalideerde panel van genen die betrokken zijn bij CT en die moeten worden onderzocht bij presentatie van een nieuw verdacht geval van CT. Het zal ook helpen bij het uitbreiden van de basiskennis van het proces van megakaryocytopoëse en trombopoëse, zowel normaal als pathologisch.