Charakterisierung neuer Kandidatengene bei humaner vererbter Thrombozytopenie (CATCH) (CATCH)

Zirkulierende Blutplättchen sind für die Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität und Funktionalität in zahlreichen pathophysiologischen Situationen, wie der Kontrolle von hämorrhagischen oder thrombotischen Ereignissen, wesentlich. Blutplättchen werden von hochspezialisierten Knochenmarkszellen, den Megakaryozyten (MKs), die einen komplexen Prozess der Differenzierung und Reifung durchlaufen, in den Kreislauf freigesetzt. Dieser Prozess beginnt mit der Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPC) des Knochenmarks in sich vergrößernde, polyploide unreife MKs, die sich zu Riesenzellen entwickeln, die an die Mikrovaskulatur des Knochenmarks angelagert sind, und schließlich Fragmente ihres Zytoplasmas in den Blutkreislauf freisetzen, aus denen die zirkulierenden Blutplättchen bestehen. Dieser letzte Schritt der MK-Reifung wird als Thrombopoese bezeichnet. Mehrere Gene sind an dem gesamten Prozess beteiligt und insbesondere an der genauen Definition sowohl der Größe als auch der Anzahl der zirkulierenden Blutplättchen. Die konstitutive Thrombozytopenie (CT) ist eine seltene hämatologische Erkrankung, die ätiologisch heterogen ist und durch eine deutlich verringerte Anzahl zirkulierender Blutplättchen gekennzeichnet ist. In den meisten Fällen geht eine Thrombozytopenie mit einer Veränderung der Zellgröße einher, die sich sehr oft in einem erhöhten mittleren Volumen äußert. Thrombozytopenie ist ein lebenslanger Zustand für den Patienten, und wenn die zirkulierenden Blutplättchen stark vermindert sind, kann dies zu hämorrhagischen Ereignissen unterschiedlichen Schweregrades führen, die möglicherweise einen dringenden Eingriff wie die Transfusion von Blutprodukten erfordern. Je nach verändertem Gen kann die CT parallel zu anderen Blutzellerkrankungen wie myelodysplastischem Syndrom oder Leukämie oder sogar zu extrahämatologischen Syndromen wie Nephropathie, Taubheit usw. vorliegen. Die CT kann jedoch schwierig zu diagnostizieren und von verschiedenen Formen erworbener Thrombozytopenie, wie z. B. idiopathischer oder medikamenteninduzierter Thrombozytopenie, schwer zu unterscheiden sein. Die endgültige Diagnose für CT basiert auf der molekularen Diagnose, die zeigen muss, dass ein abweichendes Gen und Protein, das identifizierte Mutationen enthält, die Thrombozytenproduktion verändert und zu einem klinischen CT führt.

Das Wissen über die genetischen Grundlagen von CT erweitert sich kontinuierlich, wobei bisher ~ 40 Gene als ursächlich in CT-Fällen identifiziert wurden. Diese Identifizierung basiert auf strengen Kriterien wie (1) Bioinformatik-basierter Bewertung der Pathogenität der Mutationen, (2) Genotyp-Phänotyp-Assoziation in informativen CT-Familien und (3) Reproduktion der bei den Patienten festgestellten molekularen und zellulären Anomalien durch die Verwendung von experimentellen Zell- oder Tiermodellen. Alle beteiligten Gene und Proteine ​​wirken an wichtigen Schritten während der MK-Differenzierung/-Reifung und insbesondere während der Thrombopoese. Neben wichtigen biomedizinischen Ergebnissen ist die Charakterisierung von Mutationen dieser Gene und der Auswirkungen, die sie auf verschiedene biologische Prozesse haben, auch eine unersetzliche Quelle für Entdeckungen in der grundlegenden Zellbiologie. In etwa der Hälfte der CT-Fälle mit klinischem Verdacht lässt die Genomanalyse der bekannten beteiligten Gene jedoch keine Variante in einem dieser Gene erkennen. Daher sind einige Ätiologien von CT noch unbekannt, und es sind noch viele Untersuchungen durchzuführen, um die Liste der Gene und Mutationen, die mit CT in Verbindung stehen, zu erweitern und zu ergänzen. Dies ist wichtig für die Patienten und Familien, da die Sicherstellung der CT-Diagnose Fehldiagnosen und ihre potenziell ineffizienten oder schädlichen therapeutischen Interventionen, einschließlich der Transfusion von Blutprodukten, wenn sie nicht relevant sind, vermeidet und gleichzeitig einen Vorschlag für eine angepasste heilende/präventive medizinische Maßnahme ermöglicht, insbesondere wenn das CT ist mit einem extraplättchenförmigen oder extrahämatologischen Syndrom assoziiert.

Am Ressourcen- und Kompetenzzentrum für konstitutionelle hämorrhagische Erkrankungen (CRCMHC; Universitätsklinikum Robert Debré, Paris, Frankreich) hat das Untersuchungsteam eine Kohorte von mehr als 650 Probanden aufgebaut, die sich mit CT vorstellten, von denen nur etwa die Hälfte eine genetische Diagnose erhalten hat. Unter den Patienten ohne eine solche molekulare Diagnose wurden kürzlich mehrere nicht verwandte Patienten mit einer familiären Form der Thrombozytopenie vom Untersuchungsteam untersucht und es wurde gezeigt, dass sie Varianten von Genen beherbergen, die noch nicht als formal mit dem Auftreten von CT in Verbindung gebracht wurden. Der klinische und molekulargenetische Nachweis muss jedoch durch funktionelle Studien der entsprechenden Proteinvarianten in ihrer zellulären Umgebung ergänzt werden, und dieser experimentelle, zellbiologische Ansatz der CT-Pathologie bildet die Grundlage der vorliegenden klinischen Studie. Solche Funktionsstudien umfassen:

• eine Bewertung, wie Blut-HPC, die von Patienten und Familienmitgliedern entweder mit CT oder ohne die Krankheit (letztere genommen als normale Kontrollsubjekte) erhalten wurden, sich in MKs differenzieren, wenn sie in Kulturschalen ausgesät werden, und dann zu MKs reifen, die Proplättchen bilden, die ähnlich sind die frühen Blutplättchen bildeten sich im Knochenmark, bevor sie ins Blut freigesetzt wurden. Der Zweck besteht darin, jede morphologische und Proteinexpressionsanomalie zu beobachten und zu analysieren, die in CT-Zellen vorhanden sein kann und in Nicht-CT-Zellen fehlt. Die verwendeten Techniken sind Zellkultur, mikroskopische Beobachtung und Analyse, sowohl qualitativ als auch quantitativ, von Modifikationen in der Proteinexpression und/oder -verteilung in Zellen unter Verwendung von Sonden, wie z.
• eine Bewertung der Blutplättchenfunktionen, wie z. B. ihre Fähigkeit, an der Oberfläche eines Blutgefäßes zu haften, sich dann zu aggregieren, ein Kennzeichen ihrer wesentlichen Rolle beim Stoppen von Blutungen, und ein Gerinnsel zurückzuziehen, was für ihre Rolle bei der Versiegelung eines Schadens charakteristisch ist Blutgefäß, wodurch Infektionen vermieden und das Gewebe auf die Reparatur vorbereitet werden. Ziel ist es hier, jede Veränderung dieser hochplättchenspezifischen Funktionen während der Hämostase in CT-Thrombozyten im Vergleich zu normalen Thrombozyten zu beobachten und zu analysieren, da bestimmte Gene, die die Thrombozytenproduktion im Knochenmark beeinflussen, möglicherweise auch eine Rolle bei den Funktionen zirkulierender Thrombozyten spielen. Zu verwendende Techniken sind die mikroskopische Abbildung der Blutplättchenanhaftung an experimentellen proteinbeschichteten Oberflächen oder an echtem Gefäßmaterial;
• eine Bewertung der MK/Thrombozyten-Ultrastruktur und -Biochemie, die sich auf die intrazellulären molekularen Wege konzentriert, an denen das variante Protein beteiligt ist. Zu diesem Zweck zu verwendende Techniken sind konfokale oder elektronische Mikroskopie, Proteinextraktion, -reinigung und -analyse.

Diese experimentellen Studien werden in einem Forschungslabor des National Institute for Health and Medical Research (Inserm), „Innovative Therapies in Haemostasis (IThEM)“ (Fakultät für Pharmazie – Universität Paris, Paris, Frankreich) durchgeführt. Das Labor handelt in dieser klinischen Studie auf einer kooperativen Basis mit dem CRCMHC, das vorgelagert für die medizinische, klinische und genetische Charakterisierung von Patienten und Familienmitgliedern tätig ist, die dann um eine Aufnahme in die Studie gebeten werden können. Das IThEM-Labor verfügt auch über die Expertise, Zellmodelle für die Untersuchung einer bestimmten Gen- und Proteinvariante zu generieren, die experimentell in menschliche Primärzellen oder Zelllinien im Labor eingeführt werden können, um die biologischen Veränderungen zu reproduzieren, die ursprünglich in Zellen von CT-Patienten beobachtet wurden . Dies dient dazu, den Nachweis zu stärken, dass das abweichende Gen wirklich pathogen ist, aber dieser Teil der Studie ist außerhalb der vorliegenden klinischen Studie, da für seine Durchführung kein Zugang zu biologischem Material von Patienten und Familienmitgliedern erforderlich ist.

Insgesamt zielt diese klinische Studie darauf ab, den Wirkmechanismus auf molekularer und zellulärer Ebene von neu identifizierten CT-assoziierten Genvarianten genau abzugrenzen, um die Pathogenität des Variantengens zu bestätigen oder umgekehrt zu entkräften. Es wird mehrere Ziele erfüllen, (1) dem/den Patienten eine formelle molekulare CT-Diagnose anzubieten, (2) die phänotypische Darstellung der durch diese Variante erzeugten CT-Form zu präzisieren und aufzuklären, (3) zur Verbesserung beizutragen medizinische Unterstützung der Patienten, sowohl für die Diagnose als auch für die Therapie, insbesondere wenn CT extra-Thrombozyten- und/oder extra-hämatologische Gegenstücke hat, (4) um Patienten und Familienmitgliedern eine relevante genetische Beratung zu bieten, und (5) um das validierte Panel zu erweitern Gene, die an CT beteiligt sind und bei Vorlage eines neuen CT-Verdachtsfalls untersucht werden sollen. Es wird auch dazu beitragen, das Grundwissen über den Prozess der Megakaryozytopoese und Thrombopoese, sowohl normal als auch pathologisch, zu erweitern.