Caracterização de Novos Genes Candidatos em Casos de Trombocitopenia Herdada Humana (CATCH) (CATCH)

As plaquetas sanguíneas circulantes são essenciais na manutenção da integridade e funcionalidade vascular em inúmeras situações fisiopatológicas, como o controle de eventos hemorrágicos ou trombóticos. As plaquetas são liberadas na circulação a partir de células altamente especializadas da medula óssea, os megacariócitos (MKs), que passam por um complexo processo de diferenciação e maturação. Este processo começa com a diferenciação das células progenitoras hematopoiéticas (HPC) da medula óssea em MKs poliplóides imaturas que evoluem para células gigantes apostas na microvasculatura da medula óssea e, finalmente, liberam na corrente sanguínea fragmentos de seu citoplasma que formam as plaquetas circulantes. Esta etapa final da maturação do MK é chamada de trombopoiese. Vários genes estão envolvidos em todo o processo e, particularmente, na definição precisa do tamanho e do número de plaquetas circulantes. As trombocitopenias (CT) constitutivas são doenças hematológicas raras, etiologicamente heterogéneas, caracterizadas por uma diminuição acentuada do número de plaquetas circulantes. Na maioria dos casos, a trombocitopenia é acompanhada por uma mudança no tamanho da célula que muitas vezes aparece como um aumento do volume médio. A trombocitopenia é um estado vitalício do paciente e, quando as plaquetas circulantes estão fortemente diminuídas, isso pode levar a eventos hemorrágicos de gravidade variável que podem exigir intervenção urgente, como transfusão de hemoderivados. Dependendo do gene alterado, a CT pode estar presente em paralelo com outras doenças das células sanguíneas, como a síndrome mielodisplásica ou leucemia, ou mesmo com síndromes extra-hematológicas, como nefropatia, surdez, etc. No entanto, a TC pode ser difícil de diagnosticar e diferenciar de várias formas de trombocitopenia adquirida, como trombocitopenia idiopática ou induzida por drogas. O diagnóstico final para CT é baseado no diagnóstico molecular que deve mostrar que um gene variante e uma proteína contendo mutação(ões) identificada(s) alteram a produção de plaquetas e resultam em CT clínica.

O conhecimento sobre a base genética da TC está em constante expansão, com cerca de 40 genes identificados até o momento como causadores de casos de TC. Essa identificação é baseada em critérios rigorosos, como (1) avaliação baseada em bioinformática da patogenicidade das mutações, (2) associação genótipo-fenótipo em famílias informativas de TC e (3) reprodução das anormalidades moleculares e celulares observadas nos pacientes usando modelos celulares ou animais experimentais. Todos os genes e proteínas implicados atuam em etapas importantes durante a diferenciação/maturação de MK e, particularmente, durante a trombopoiese. Além de importantes resultados biomédicos, a caracterização de mutações desses genes e o impacto que eles têm em vários processos biológicos também é uma fonte insubstituível de descobertas na biologia celular básica. No entanto, em cerca de metade dos casos de TC clinicamente suspeitos, a análise genômica dos genes implicados conhecidos não recupera uma variante em um desses genes. Assim, algumas etiologias da TC ainda são desconhecidas, havendo ainda muita investigação a ser realizada para ampliar e complementar a lista de genes e mutações implicados na TC. Isso é importante para os pacientes e familiares, pois garantir o diagnóstico de TC evitará erros de diagnóstico e suas possíveis intervenções terapêuticas ineficientes ou deletérias, incluindo transfusão de hemoderivados quando não pertinente, ao mesmo tempo em que permitirá propor uma ação médica curativa/preventiva adaptada, especialmente quando a TC está associada a uma síndrome extraplaquetária ou extra-hematológica.

No Centro de Recursos e Competência para Doenças Hemorrágicas Constitucionais (CRCMHC; University Hospital Robert Debré, Paris, França), a equipe de investigação construiu uma coorte de mais de 650 indivíduos com CT, dos quais apenas cerca de metade recebeu um diagnóstico genético. Entre os pacientes sem tal diagnóstico molecular, vários pacientes não relacionados com uma forma familiar de trombocitopenia foram recentemente investigados pela equipe de investigação e demonstraram abrigar variantes de genes ainda não descritos como formalmente implicados na ocorrência de CT. No entanto, evidências genéticas clínicas e moleculares devem ser completadas por estudos funcionais das proteínas variantes correspondentes em seu ambiente celular, e essa abordagem experimental de biologia celular da patologia CT constitui a base do presente ensaio clínico. Esses estudos funcionais incluirão:

• uma avaliação de como o sangue HPC obtido de pacientes e familiares com CT ou livre da doença (estes últimos tomados como indivíduos de controle normais), diferenciam-se em MKs quando semeados em placas de cultura, então maturam em MKs formando proplaquetas, que são semelhantes a as primeiras plaquetas formadas na medula óssea antes de serem liberadas no sangue. O objetivo é observar e analisar qualquer anormalidade morfológica e de expressão proteica que possa estar presente em células CT e ausente em células não CT. As técnicas utilizadas são cultura celular, observação microscópica e análise, qualitativa e quantitativa, de modificações na expressão e/ou distribuição de proteínas nas células, utilizando sondas como anticorpos produzidos contra as proteínas de interesse;
• uma avaliação das funcionalidades das plaquetas, como sua capacidade de aderir à superfície de um vaso sanguíneo e, em seguida, agregar, uma característica de seu papel essencial na interrupção do sangramento, e retrair um coágulo, característica de seu papel na vedação de um danificado vaso sanguíneo, evitando infecções e preparando o tecido para reparo. O objetivo aqui é observar e analisar qualquer alteração dessas funções altamente específicas de plaquetas durante a hemostasia em plaquetas CT em comparação com plaquetas normais, porque certos genes que afetam a produção de plaquetas na medula óssea também podem desempenhar um papel nas funções das plaquetas circulantes. As técnicas a serem usadas são imagens de microscopia de aderência de plaquetas a superfícies revestidas com proteínas experimentais ou a material vascular genuíno;
• uma avaliação da ultraestrutura e bioquímica de MK/plaquetas, com foco nas vias moleculares intracelulares nas quais a proteína variante está implicada. As técnicas a utilizar para este fim são microscopia confocal ou electrónica, extracção de proteínas, purificação e análise.

Estes estudos experimentais são conduzidos em um laboratório de pesquisa do Instituto Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (Inserm), "Terapias Inovadoras em Hemostasia (IThEM)" (Faculdade de Farmácia - Universidade de Paris, Paris, França). O laboratório está a atuar neste ensaio clínico em colaboração com o CRCMHC, que está a funcionar a montante para a caracterização médica, clínica e genética de doentes e familiares que poderão ser posteriormente solicitados a inscrever-se no ensaio. O laboratório IThEM também tem a capacidade de gerar modelos celulares para o estudo de um determinado gene e variante de proteína, que podem ser introduzidos experimentalmente em células primárias ou linhagens celulares humanas de laboratório, a fim de reproduzir as alterações biológicas originalmente observadas nas células dos pacientes de CT . Isso serve para fortalecer a demonstração de que o gene variante é verdadeiramente patogênico, mas esta parte do estudo está fora do presente ensaio clínico porque não requer acesso a material biológico dos pacientes e familiares para ser realizado.

No geral, este ensaio clínico visa delinear com precisão o mecanismo de ação nos níveis molecular e celular de variantes genéticas associadas a CT recém-identificadas, a fim de confirmar ou, inversamente, invalidar a patogenicidade do gene variante. Ele cumprirá vários objetivos, (1) oferecer ao(s) paciente(s) um diagnóstico molecular formal de CT, (2) precisar e elucidar a apresentação fenotípica da forma de CT gerada por esta variante, (3) ajudar a melhorar suporte médico dos pacientes, tanto para diagnóstico quanto para terapia, particularmente se a TC tiver contrapartes extraplaquetárias e/ou extra-hematológicas, (4) fornecer aos pacientes e familiares um aconselhamento genético pertinente e (5) expandir o painel validado de genes implicados na TC e a serem explorados na apresentação de um novo caso suspeito de TC. Também ajudará a ampliar o conhecimento básico do processo de megacariocitopoiese e trombopoiese, tanto normal quanto patológica.