Caractérisation de nouveaux gènes candidats dans les cas de thrombocytopénie héréditaire humaine (CATCH) (CATCH)

Les plaquettes sanguines circulantes sont essentielles au maintien de l'intégrité et de la fonctionnalité vasculaire dans de nombreuses situations physiopathologiques, telles que le contrôle des événements hémorragiques ou thrombotiques. Les plaquettes sont libérées dans la circulation à partir de cellules hautement spécialisées de la moelle osseuse, les mégacaryocytes (MK) qui subissent un processus complexe de différenciation et de maturation. Ce processus commence par la différenciation des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) de la moelle osseuse en MKs immatures polyploïdes en expansion qui évoluent en cellules géantes apposées sur la microvasculature de la moelle osseuse, et libèrent finalement dans la circulation sanguine des fragments de leur cytoplasme qui forment les plaquettes en circulation. Cette étape ultime de la maturation MK est appelée thrombopoïèse. Plusieurs gènes sont impliqués dans l'ensemble du processus, et en particulier dans la définition précise à la fois de la taille et du nombre de plaquettes en circulation. Les thrombocytopénies constitutives (TC) sont des maladies hématologiques rares étiologiquement hétérogènes, caractérisées par une diminution marquée du nombre de plaquettes circulantes. Dans la plupart des cas, la thrombocytopénie s'accompagne d'une modification de la taille des cellules qui se traduit très souvent par une augmentation du volume moyen. La thrombocytopénie est un état permanent pour le patient, et lorsque les plaquettes circulantes sont fortement diminuées, cela peut entraîner des événements hémorragiques de gravité variable pouvant nécessiter une intervention urgente telle qu'une transfusion de produits sanguins. Selon le gène altéré, le CT peut être présent en parallèle avec d'autres maladies des cellules sanguines, comme le syndrome myélodysplasique ou la leucémie, voire avec des syndromes extra-hématologiques, comme la néphropathie, la surdité, etc. Cependant, CT peut être difficile à diagnostiquer et difficile à différencier de diverses formes de thrombocytopénie acquise, telles que la thrombocytopénie idiopathique ou médicamenteuse. Le diagnostic ultime de CT est basé sur le diagnostic moléculaire qui doit montrer qu'un gène variant et une protéine porteuse de mutation(s) identifiée(s) modifient la production de plaquettes et entraînent une CT clinique.

Les connaissances sur la base génétique de CT ne cessent de s'étendre, avec environ 40 gènes identifiés jusqu'à présent comme causatifs dans les cas de CT. Cette identification est basée sur des critères rigoureux tels que (1) l'évaluation bioinformatique de la pathogénicité des mutations, (2) l'association génotype - phénotype dans les familles CT informatives, et (3) la reproduction des anomalies moléculaires et cellulaires constatées chez les patients. en utilisant des modèles expérimentaux cellulaires ou animaux. Tous les gènes et protéines impliqués agissent à des étapes importantes au cours de la différenciation/maturation des MK, et en particulier au cours de la thrombopoïèse. Outre des résultats biomédicaux importants, la caractérisation des mutations de ces gènes et l'impact qu'elles ont sur divers processus biologiques est également une source irremplaçable de découvertes en biologie cellulaire fondamentale. Cependant, dans environ la moitié des cas de CT cliniquement suspectés, l'analyse génomique des gènes impliqués connus ne permet pas de retrouver une variante dans l'un de ces gènes. Ainsi, certaines étiologies du CT sont encore inconnues, et il reste encore beaucoup d'investigations à réaliser afin d'élargir et de compléter la liste des gènes et mutations impliqués dans le CT. Ceci est important pour les patients et les familles, car assurer le diagnostic du CT évitera les erreurs de diagnostic et ses éventuelles interventions thérapeutiques inefficaces ou délétères, y compris la transfusion de produits sanguins lorsqu'elle n'est pas pertinente, tout en permettant de proposer une action médicale curative/préventive adaptée, en particulier lorsque le scanner est associé à un syndrome extra-plaquettaire ou extra-hématologique.

Au Centre de ressources et de compétences pour les maladies hémorragiques constitutionnelles (CRCMHC ; CHU Robert Debré, Paris, France), l'équipe d'investigation a constitué une cohorte de plus de 650 sujets présentant une TDM, dont seulement la moitié environ ont reçu un diagnostic génétique. Parmi les patients sans un tel diagnostic moléculaire, plusieurs patients non apparentés atteints d'une forme familiale de thrombocytopénie ont été récemment étudiés par l'équipe d'investigation et ont montré qu'ils hébergent des variantes de gènes non encore décrits comme formellement impliqués dans la survenue de CT. Cependant, les preuves génétiques cliniques et moléculaires doivent être complétées par des études fonctionnelles des protéines variantes correspondantes dans leur environnement cellulaire, et cette approche expérimentale de biologie cellulaire de la pathologie CT constitue la base du présent essai clinique. Ces études fonctionnelles comprendront :

• une évaluation de la façon dont le sang HPC obtenu à partir de patients et de membres de la famille atteints de CT ou indemnes de la maladie (ces derniers étant pris comme sujets témoins normaux), se différencie en MK lorsqu'il est ensemencé dans des boîtes de culture, puis mûrit en MK formant des proplaquettes, qui sont similaires à les premières plaquettes formées dans la moelle osseuse avant leur libération dans le sang. Le but est d'observer et d'analyser toute anomalie morphologique et d'expression protéique qui peut être présente dans les cellules CT et absente dans les cellules non CT. Les techniques utilisées sont la culture cellulaire, l'observation au microscope et l'analyse, tant qualitative que quantitative, des modifications de l'expression et/ou de la distribution des protéines dans les cellules, à l'aide de sondes telles que des anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt ;
• une évaluation des fonctionnalités plaquettaires, telles que leur capacité à adhérer à la surface d'un vaisseau sanguin, puis à s'agréger, signe distinctif de leur rôle essentiel dans l'arrêt du saignement, et à rétracter un caillot, caractéristique de leur rôle dans l'étanchéité d'un vaisseau lésé vaisseau sanguin, évitant ainsi les infections et préparant le tissu pour la réparation. L'objectif ici est d'observer et d'analyser toute altération de ces fonctions hautement plaquettaires au cours de l'hémostase des plaquettes CT par rapport aux plaquettes normales, car certains gènes affectant la production de plaquettes dans la moelle osseuse peuvent également jouer un rôle dans les fonctions des plaquettes circulantes. Les techniques à utiliser sont l'imagerie par microscopie de l'adhérence des plaquettes à des surfaces expérimentales recouvertes de protéines ou à du matériel vasculaire authentique ;
• une évaluation de l'ultrastructure et de la biochimie MK/plaquettes, en se concentrant sur les voies moléculaires intracellulaires dans lesquelles la protéine variante est impliquée. Les techniques à utiliser à cette fin sont la microscopie confocale ou électronique, l'extraction, la purification et l'analyse des protéines.

Ces études expérimentales sont menées dans un laboratoire de recherche de l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm), "Thérapies Innovantes en Hémostase (IThEM)" (Faculté de Pharmacie - Université de Paris, Paris, France). Le laboratoire intervient dans cet essai clinique en collaboration avec le CRCMHC, qui intervient en amont pour la caractérisation médicale, clinique et génétique des patients et des proches qui peuvent ensuite être sollicités pour l'inscription à l'essai. Le laboratoire IThEM possède également l'expertise pour générer des modèles cellulaires pour l'étude d'un gène particulier et d'une variante protéique, qui peuvent être introduits expérimentalement dans des cellules primaires ou des lignées cellulaires humaines de laboratoire afin de reproduire les altérations biologiques initialement observées dans les cellules des patients CT. . Cela sert à renforcer la démonstration que le gène variant est véritablement pathogène, mais cette partie de l'étude est en dehors du présent essai clinique car elle ne nécessite pas l'accès au matériel biologique des patients et des membres de la famille pour être réalisée.

Au total, cet essai clinique vise à délimiter précisément le mécanisme d'action aux niveaux moléculaire et cellulaire des variants du gène associé à CT nouvellement identifiés, afin de confirmer ou, au contraire, d'invalider la pathogénicité du gène variant. Il remplira plusieurs objectifs, (1) offrir au(x) patient(s) un diagnostic moléculaire formel de CT, (2) préciser et élucider la présentation phénotypique de la forme de CT générée par ce variant, (3) aider à améliorer l'accompagnement médical des patients, tant pour le diagnostic que pour la thérapeutique, notamment si le scanner a des contreparties extra-plaquettaires et/ou extra-hématologiques, (4) de fournir aux patients et aux proches un conseil génétique pertinent, et (5) d'élargir le panel validé de gènes impliqués dans le CT et à explorer sur présentation d'un nouveau cas suspect de CT. Cela aidera également à étendre les connaissances de base du processus de mégacaryocytopoïèse et de thrombopoïèse, à la fois normales et pathologiques.