Karakterisering af nye kandidatgener i tilfælde af human arvelig trombocytopeni (CATCH) (CATCH)

Cirkulerende blodplader er afgørende for opretholdelsen af ​​vaskulær integritet og funktionalitet i adskillige patofysiologiske situationer, såsom kontrol af hæmoragiske eller trombotiske hændelser. Blodplader frigives til kredsløbet fra højt specialiserede knoglemarvsceller, megakaryocytterne (MK'er), der gennemgår en kompleks proces med differentiering og modning. Denne proces starter med differentieringen af ​​knoglemarvshæmatopoietiske progenitorceller (HPC) til forstørrende, polyploide umodne MK'er, der udvikler sig til gigantiske celler anbragt på knoglemarvens mikrovaskulatur og til sidst frigiver fragmenter af deres cytoplasma, der danner de cirkulerende blodplader, til blodstrømmen. Dette ultimative trin af MK-modning kaldes trombopoiesis. Flere gener er impliceret i hele processen, og især i præcist at definere både størrelsen og antallet af cirkulerende blodplader. Konstitutiv trombocytopeni (CT) er sjældne hæmatologiske sygdomme, der er ætiologisk heterogene, karakteriseret ved et markant reduceret antal cirkulerende blodplader. I de fleste tilfælde er trombocytopeni ledsaget af en ændring i cellestørrelse, der meget ofte viser sig som et øget middelvolumen. Trombocytopeni er en livslang status for patienten, og når cirkulerende blodplader er stærkt formindsket, kan dette føre til hæmoragiske hændelser af varierende sværhedsgrad, som kan kræve akut indgreb såsom transfusion af blodprodukter. Afhængigt af det ændrede gen, kan CT være til stede parallelt med andre blodcellesygdomme, såsom myelodysplastisk syndrom eller leukæmi, eller endda med ekstra-hæmatologiske syndromer, såsom nefropati, døvhed osv. CT kan dog være svær at diagnosticere og svær at skelne fra forskellige former for erhvervet trombocytopeni, såsom idiopatisk eller lægemiddelinduceret trombocytopeni. Den ultimative diagnose for CT er baseret på den molekylære diagnose, der skal vise, at et variantgen og et protein, der rummer identificerede mutationer, ændrer blodpladeproduktionen og resulterer i klinisk CT.

Viden om det genetiske grundlag for CT udvides løbende, med ~ 40 gener identificeret indtil videre som forårsagende i CT-tilfælde. Denne identifikation er baseret på strenge kriterier såsom (1) bioinformatik-baseret evaluering af mutationernes patogenicitet, (2) genotype - fænotype association i informative CT-familier og (3) reproduktion af de molekylære og cellulære abnormiteter, der er noteret hos patienterne. ved at bruge eksperimentelle cellulære eller dyremodeller. Alle implicerede gener og proteiner virker på vigtige trin under MK-differentiering/modning, og især under trombopoiesis. Ud over vigtige biomedicinske resultater er karakterisering af mutationer af disse gener og den indvirkning, de har på forskellige biologiske processer, også en uerstattelig kilde til opdagelser i grundlæggende cellebiologi. I omkring halvdelen af ​​klinisk mistænkte CT-tilfælde genfinder genomisk analyse af de kendte implicerede gener imidlertid ikke en variant i et af disse gener. Således er nogle ætiologier af CT endnu ukendte, og der er stadig en masse undersøgelser at udføre for at udvide og komplementere listen over gener og mutationer impliceret i CT. Dette er vigtigt for patienterne og familierne, fordi sikring af diagnosen CT vil undgå fejldiagnosticering og dens potentielle ineffektive eller skadelige terapeutiske indgreb, herunder blodprodukttransfusion, når det ikke er relevant, samtidig med at det tillader et forslag om en tilpasset helbredende/forebyggende medicinsk handling, især når CT er forbundet med et ekstra-blodplade- eller ekstra-hæmatologisk syndrom.

På ressource- og kompetencecenteret for konstitutionelle hæmoragiske sygdomme (CRCMHC; Universitetshospitalet Robert Debré, Paris, Frankrig), har undersøgelsesholdet opbygget en kohorte på mere end 650 forsøgspersoner, der præsenterer sig med CT, som kun omkring halvdelen har fået en genetisk diagnose. Blandt patienterne uden en sådan molekylær diagnose er adskillige, ubeslægtede patienter med en familiær form for trombocytopeni for nylig blevet undersøgt af undersøgelsesholdet og vist sig at rumme varianter af gener, der endnu ikke er beskrevet som formelt impliceret i forekomsten af ​​CT. Imidlertid skal kliniske og molekylærgenetiske beviser fuldendes af funktionelle undersøgelser af de tilsvarende variantproteiner i deres cellulære miljø, og denne eksperimentelle, cellebiologiske tilgang til CT-patologien danner grundlaget for det nuværende kliniske forsøg. Sådanne funktionelle undersøgelser vil omfatte:

• en evaluering af, hvordan blod-HPC opnået fra patienter og familiemedlemmer enten med CT eller fri for sygdommen (sidstnævnte taget som normale kontrolpersoner), differentierer til MK'er, når de udsåes i kulturskåle, og derefter modnes til MK'er, der danner propplader, der svarer til de tidlige blodplader dannet i knoglemarven før deres frigivelse til blod. Formålet er at observere og analysere enhver morfologisk og proteinekspressionsabnormitet, der kan være til stede i CT-celler og fraværende i ikke-CT-celler. De anvendte teknikker er cellekultur, mikroskopobservation og analyse, både kvalitativ og kvantitativ, af modifikationer i proteinekspression og/eller fordeling i celler, ved anvendelse af prober såsom antistoffer rejst mod proteinerne af interesse;
• en evaluering af trombocytfunktionaliteter, såsom deres evne til at klæbe til overfladen af ​​et blodkar og derefter aggregere, et kendetegn for deres væsentlige rolle i at stoppe blødning, og til at trække en blodprop tilbage, karakteristisk for deres rolle i forseglingen af ​​en beskadiget blodkar, hvorved infektioner undgås og vævet forberedes til reparation. Formålet her er at observere og analysere enhver ændring af disse meget blodpladespecifikke funktioner under hæmostase i CT-blodplader sammenlignet med normale blodplader, fordi visse gener, der påvirker blodpladeproduktionen i knoglemarven, også kan spille en rolle i funktionerne af cirkulerende blodplader. Teknikker, der skal anvendes, er mikroskopibilleddannelse af trombocytadhærens til eksperimentelle proteinovertrukne overflader eller til ægte vaskulært materiale;
• en evaluering af MK/blodplade-ultrastrukturen og biokemi, med fokus på de intracellulære molekylære veje, som variantproteinet er impliceret i. Teknikker til brug til dette formål er konfokal eller elektronisk mikroskopi, proteinekstraktion, oprensning og analyse.

Disse eksperimentelle undersøgelser udføres i et forskningslaboratorium fra National Institute for Health and Medical Research (Inserm), "Innovative Therapies in Haemostasis (IThEM)" (Fakultet for Farmaceut - University of Paris, Paris, Frankrig). Laboratoriet agerer i dette kliniske forsøg på et samarbejde med CRCMHC, som opererer opstrøms for den medicinske, kliniske og genetiske karakterisering af patienter og familiemedlemmer, som derefter kan blive bedt om tilmelding til forsøget. IThEM-laboratoriet har også ekspertisen til at generere cellulære modeller til undersøgelse af et bestemt gen og proteinvariant, der eksperimentelt kan introduceres i humane primære laboratorieceller eller cellelinjer for at reproducere de biologiske ændringer, der oprindeligt blev observeret i celler fra CT-patienter. . Dette tjener til at styrke påvisningen af, at variantgenet virkelig er patogent, men denne del af undersøgelsen ligger uden for det nuværende kliniske forsøg, fordi det ikke kræver adgang til biologisk materiale fra patienter og familiemedlemmer for at kunne udføres.

I det hele taget sigter dette kliniske forsøg på præcist at afgrænse virkningsmekanismen på de molekylære og cellulære niveauer af nyligt identificerede CT-associerede genvarianter for at bekræfte eller omvendt invalidere patogeniciteten af ​​variantgenet. Det vil opfylde flere formål, (1) at tilbyde patienten(e) en formel molekylær diagnose af CT, (2) at præcisere og belyse den fænotypiske præsentation af formen af ​​CT genereret af denne variant, (3) at hjælpe med at forbedre patienters medicinske støtte, både til diagnose og terapi, især hvis CT har ekstra blodplader og/eller ekstra-hæmatologiske modstykker, (4) for at give patienter og familiemedlemmer en relevant genetisk rådgivning, og (5) for at udvide det validerede panel af gener impliceret i CT og skal udforskes ved præsentation af et nyt mistænkt tilfælde af CT. Det vil også hjælpe med at udvide den grundlæggende viden om processen med megakaryocytopoiesis og trombopoiesis, både normal og patologisk.