Caracterización de nuevos genes candidatos en casos de trombocitopenia hereditaria humana (CATCH) (CATCH)

Las plaquetas sanguíneas circulantes son esenciales en el mantenimiento de la integridad y funcionalidad vascular en numerosas situaciones fisiopatológicas, como el control de eventos hemorrágicos o trombóticos. Las plaquetas se liberan a la circulación desde células de la médula ósea altamente especializadas, los megacariocitos (MK), que se someten a un complejo proceso de diferenciación y maduración. Este proceso comienza con la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas (HPC, por sus siglas en inglés) de la médula ósea en MK inmaduras poliploides que se agrandan y evolucionan hacia células gigantes ypuestas en la microvasculatura de la médula ósea, y finalmente liberan en el torrente sanguíneo fragmentos de su citoplasma que forman las plaquetas circulantes. Este último paso de la maduración de MK se denomina trombopoyesis. Múltiples genes están implicados en todo el proceso y, en particular, en la definición precisa tanto del tamaño como del número de plaquetas circulantes. Las trombocitopenias constitutivas (TC) son enfermedades hematológicas raras, etiológicamente heterogéneas, caracterizadas por una marcada disminución del número de plaquetas circulantes. En la mayoría de los casos, la trombocitopenia se acompaña de un cambio en el tamaño de las células que muy a menudo se manifiesta como un aumento del volumen medio. La trombocitopenia es un estado de por vida para el paciente, y cuando las plaquetas circulantes están fuertemente disminuidas, esto puede provocar eventos hemorrágicos de gravedad variable que pueden requerir una intervención urgente, como una transfusión de hemoderivados. Según el gen que esté alterado, la TC puede presentarse en paralelo con otras enfermedades de las células sanguíneas, como el síndrome mielodisplásico o la leucemia, o incluso con síndromes extrahematológicos, como la nefropatía, la sordera, etc. Sin embargo, la TC puede ser difícil de diagnosticar y diferenciar de diversas formas de trombocitopenia adquirida, como la trombocitopenia idiopática o inducida por fármacos. El diagnóstico definitivo para la TC se basa en el diagnóstico molecular que debe mostrar que una variante genética y una proteína que albergan mutaciones identificadas alteran la producción de plaquetas y dan como resultado una TC clínica.

El conocimiento sobre la base genética de la TC se expande continuamente, con ~ 40 genes identificados hasta el momento como causales en los casos de TC. Esta identificación se basa en criterios rigurosos como (1) evaluación basada en bioinformática de la patogenicidad de las mutaciones, (2) asociación genotipo - fenotipo en familias CT informativas y (3) reproducción de las anomalías moleculares y celulares observadas en los pacientes. mediante el uso de modelos celulares o animales experimentales. Todos los genes y proteínas implicados actúan en pasos importantes durante la diferenciación/maduración de MK, y particularmente durante la trombopoyesis. Además de importantes resultados biomédicos, la caracterización de las mutaciones de estos genes y el impacto que tienen en varios procesos biológicos es también una fuente insustituible de descubrimientos en biología celular básica. Sin embargo, en aproximadamente la mitad de los casos de TC con sospecha clínica, el análisis genómico de los genes implicados conocidos no recupera una variante en uno de estos genes. Por lo tanto, aún se desconocen algunas etiologías de la TC, y aún queda mucha investigación por realizar para ampliar y complementar la lista de genes y mutaciones implicadas en la TC. Esto es importante para los pacientes y familiares, porque asegurar el diagnóstico de la TC evitará diagnósticos erróneos y sus potenciales intervenciones terapéuticas ineficientes o deletéreas, incluyendo la transfusión de hemoderivados cuando no sea pertinente, al tiempo que permitirá proponer una actuación médica curativa/preventiva adecuada, especialmente cuando la TC se asocia a un síndrome extraplaquetario o extrahematológico.

En el Centro de Recursos y Competencia para Enfermedades Hemorrágicas Constitucionales (CRCMHC; Hospital Universitario Robert Debré, París, Francia), el equipo de investigación ha creado una cohorte de más de 650 sujetos que presentan CT, de los cuales solo alrededor de la mitad han recibido un diagnóstico genético. Entre los pacientes sin dicho diagnóstico molecular, el equipo de investigación investigó recientemente a varios pacientes no relacionados con una forma familiar de trombocitopenia y se demostró que albergan variantes de genes que aún no se han descrito como formalmente implicados en la aparición de CT. Sin embargo, la evidencia genética molecular y clínica debe completarse con estudios funcionales de las proteínas variantes correspondientes en su entorno celular, y este enfoque de biología celular experimental de la patología CT constituye la base del presente ensayo clínico. Dichos estudios funcionales incluirán:

• una evaluación de cómo las HPC sanguíneas obtenidas de pacientes y familiares con CT o libres de la enfermedad (estos últimos tomados como sujetos de control normales), se diferencian en MK cuando se siembran en placas de cultivo, luego maduran en MK formando proplaquetas, que son similares a las primeras plaquetas se formaron en la médula ósea antes de su liberación a la sangre. El propósito es observar y analizar cualquier anomalía morfológica y de expresión de proteínas que pueda estar presente en las células CT y ausente en las células no CT. Las técnicas utilizadas son el cultivo celular, la observación al microscopio y el análisis, tanto cualitativo como cuantitativo, de las modificaciones en la expresión y/o distribución de proteínas en las células, utilizando sondas como anticuerpos levantados contra las proteínas de interés;
• una evaluación de las funcionalidades de las plaquetas, como su capacidad para adherirse a la superficie de un vaso sanguíneo y luego agregarse, un sello distintivo de su función esencial para detener el sangrado, y para retraer un coágulo, característica de su función en el sellado de un vaso sanguíneo dañado vaso sanguíneo, evitando infecciones y preparando el tejido para su reparación. El objetivo aquí es observar y analizar cualquier alteración de estas funciones altamente específicas de plaquetas durante la hemostasia en plaquetas CT en comparación con plaquetas normales, porque ciertos genes que afectan la producción de plaquetas en la médula ósea también pueden desempeñar un papel en las funciones de las plaquetas circulantes. Las técnicas que se utilizarán son imágenes de microscopía de la adherencia de las plaquetas a superficies experimentales recubiertas de proteína oa material vascular genuino;
• una evaluación de la ultraestructura y bioquímica de MK/plaquetas, centrándose en las vías moleculares intracelulares en las que está implicada la proteína variante. Las técnicas a utilizar para este fin son la microscopía confocal o electrónica, la extracción, purificación y análisis de proteínas.

Estos estudios experimentales se llevan a cabo en un laboratorio de investigación del Instituto Nacional de Salud e Investigaciones Médicas (Inserm), "Terapias Innovadoras en Hemostasia (IThEM)" (Facultad de Farmacia - Universidad de París, París, Francia). El laboratorio está actuando en este ensayo clínico en colaboración con el CRCMHC, que está operando aguas arriba para la caracterización médica, clínica y genética de los pacientes y familiares a los que luego se les puede solicitar la inscripción en el ensayo. El laboratorio IThEM también tiene la experiencia para generar modelos celulares para el estudio de un gen y una variante de proteína en particular, que se pueden introducir experimentalmente en células o líneas celulares primarias humanas de laboratorio para reproducir las alteraciones biológicas observadas originalmente en las células de los pacientes con TC. . Esto sirve para fortalecer la demostración de que el gen variante es verdaderamente patógeno, pero esta parte del estudio está fuera del presente ensayo clínico porque no requiere acceso a material biológico de los pacientes y familiares para poder realizarse.

En general, este ensayo clínico tiene como objetivo delinear con precisión el mecanismo de acción a nivel molecular y celular de las variantes genéticas asociadas a CT recientemente identificadas, para confirmar o, por el contrario, invalidar la patogenicidad del gen variante. Cumplirá varios objetivos, (1) ofrecer al paciente un diagnóstico molecular formal de TC, (2) precisar y dilucidar la presentación fenotípica de la forma de TC generada por esta variante, (3) ayudar a mejorar apoyo médico de los pacientes, tanto para el diagnóstico como para la terapia, particularmente si los TC tienen contrapartes extraplaquetarias y/o extrahematológicas, (4) brindar a los pacientes y familiares el asesoramiento genético pertinente, y (5) ampliar el panel validado de genes implicados en la TC y que se explorarán ante la presentación de un nuevo caso sospechoso de TC. También ayudará a ampliar los conocimientos básicos del proceso de megacariocitopoyesis y trombopoyesis, tanto normales como patológicas.