Srdeční mitochondriální funkce u explantovaných lidských srdcí

Pozadí:

Léčba srdečního selhání se v posledních desetiletích výrazně zlepšila. Navzdory tomuto zlepšení může onemocnění přejít do konečného stádia, kdy lékaři nemají jinou možnost léčby než transplantaci srdce (HTx). Základem srdečního selhání je více etiologií. Kardiomyopatie je hlavní příčinou HTx v jakékoli věkové skupině, přičemž onemocnění koronárních tepen je druhou nejčastější příčinou u dospělých pacientů.

Změny v mitochondriální funkci byly rozpoznány jako klíčové faktory srdečního selhání. Pochopení komplexní interakce mitochondrií v regulaci metabolismu a buněčné apoptóze přineslo nové pohledy do výzkumu srdečního selhání. Nyní je známo, že při srdečním selhání se mění hustota mitochondrií myokardu a jejich funkce a integrita je narušena.

Během transplantace je nemocné srdce odstraněno, což poskytuje jedinečnou příležitost k odběru vzorků vhodných pro důkladné mitochondriální vyšetření.

Odebrané vzorky tkáně myokardu budou vyhodnoceny pomocí respirometrie s vysokým rozlišením, která zkoumá dýchací kapacitu permeabilizovaných myokardiálních vláken vázanou na glukózu. Respirační kapacita v nemocných vláknech bude porovnána s dechovou kapacitou ve vláknech od zdravých koronárních pacientů s HTx transplantovaných 1 až 2 roky před získáním vláken.

Doufejme, že poznatky získané z tohoto výzkumu přispějí k důležitým poznatkům o nemocném energetickém metabolismu myokardu. Tyto znalosti mohou připravit cestu pro vývoj léčebných postupů zaměřených na dodávku energetického substrátu pro tvorbu adenosin-trifosfátu produkovaného mitochondriemi a také na mitochondriální funkci v selhávajícím srdci.

Hypotéza:

Patologická funkce myokardu pozorovaná u srdečního selhání souvisí s dysfunkčními srdečními mitochondriemi.

Objektivní:

Zkoumat, zda srdeční mitochondriální funkce v konečném stádiu srdečního selhání mnoha etiologií je horší než mitochondriální funkce u transplantovaných srdcí bez známek rejekce nebo vaskulopatie.

Design a koncový bod:

Funkce mitochondrií myokardu analyzovaná z 24 explantovaných srdcí bude porovnána s endomyokardiálními biopsiemi od 20 pacientů s HTx při plánovaných biopsiích (1 nebo 2 roky po implantaci).

Cíle: 1) Mitochondriální respirační kapacita. 2) Funkce mitochondriálního komplexu, integrita vnější membrány a obsah mitochondrií.

Metody:

Respirometrie s vysokým rozlišením:

Respirometrie s vysokým rozlišením se používá k měření mitochondriální respirační kapacity v endomyokardiálních biopsiích. Po vhodné přípravě se dvě biopsie přenesou na oxygraf (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Rakousko) pro respirometrii s vysokým rozlišením. Mitochondriální respirační kapacita bude analyzována krok za krokem pomocí titrací substrátů a inhibitorů pro hodnocení respirace ve vláknech spojené s glukózou. Respirometrická analýza s vysokým rozlišením se provádí do 8 hodin po odběru biopsie.

Po analýze bude tkáň rychle zmražena v kapalném dusíku a uložena ve výzkumné biobance při -80 stupních Celsia, dokud se neprovede vyšetření aktivity citrátsyntázy. Poté bude veškerá zbývající tkáň zničena.

Elektronová mikroskopie:

Vzorek z každé biopsie použitý pro respirometrii s vysokým rozlišením bude použit pro elektronovou mikroskopii (EM) k hodnocení mitochondriální objemové hustoty (MitoVD) a integrity. Vzorky svalů jsou fixovány po dobu 24 hodin v glutaraldehydu a promyty 4x15 minut Na-kakodylátovým pufrem před odlitím do Eponu. Odlitá tkáň Epon bude uložena ve výzkumné biobance až do EM analýzy. Ultratenké řezy Eponových bloků (60 nm) jsou řezány ve třech hloubkách a obarveny acetátem uranylu a citrátem olovnatým. Zobrazování se provádí transmisním elektronovým mikroskopem EM 208 a kamerou Megaview III. Všechna vlákna jsou fotografována při 10 000násobném zvětšení v náhodném pořadí. MitoVD se odhaduje z mitochondriální frakční oblasti a v konečné analýze budou použita pouze odlišná vlákna.

Statistika:

Normálně rozdělená data budou prezentována jako průměr ± standardní odchylka; nenormálně rozložená data budou prezentována jako medián a mezikvartilové rozmezí. Kategorické údaje jsou prezentovány jako absolutní hodnoty nebo procenta. Histogramy a Q-Q grafy budou použity pro kontrolu spojitých hodnot pro normalitu. Rozdíly mezi skupinami budou hodnoceny t-testem pro data s normálním rozložením a Mann-Whitney U testem pro data s nenormálním rozložením. Statistická významnost při p-hodnotě <0,05.

Vzorový výpočet velikosti:

V současné době neexistuje žádné test-retest hodnocení mitochondriální respirační analýzy v endomyokardiálních biopsiích z explantovaných lidských srdcí. Nedávná studie provedená na našem oddělení o biopsiích myokardu však prokázala, že celková velikost vzorku 40 lidských subjektů v uspořádání paralelních skupin 1:1 byla schopna identifikovat rozdíly mezi těmito dvěma skupinami (nepublikovaná data).

Sběr a zpracování dat:

Zdrojová data budou zaznamenána v elektronickém záznamu pacienta nebo na konkrétních pracovních listech.

Pro sběr dat bude vytvořen centralizovaný elektronický formulář pro hlášení případů (CRF). Data budou uložena až do dokončení projektu, poté budou odeslána do dánského archivu dat.

Perspektivy:

HTx je zlatým standardem léčby pro pacienty trpící konečným stadiem srdečního selhání, ale její omezení nelze ignorovat. Za prvé, výkon je provázen značným rizikem a značné procento pacientů trpí akutním selháním štěpu. Kromě toho mají pacienti s HTx vyšší riziko závažných infekcí a rakoviny a až 50 % pacientů s HTx trpí vaskulopatií srdečního aloštěpu 10 let po transplantaci, z nichž všechny mají vysokou souvislost s mortalitou. Proto je odložení HTx žádoucí, pokud lze udržet zdraví a kvalitu života na přijatelné úrovni. V tomto kontextu se mitochondriální funkce zdá být klíčová, protože přístupy k hodnocení mitochondriální funkce v selhávajícím srdci mohou připravit cestu pro nové algoritmy následného sledování a dokonce i cíle léčby.