Funkcja mitochondriów serca w eksplantowanych ludzkich sercach

Tło:

Leczenie niewydolności serca uległo znacznej poprawie w ostatnich dziesięcioleciach. Pomimo tej poprawy choroba może przejść w stadium schyłkowe, pozostawiając lekarzom jedyną możliwość leczenia poza przeszczepem serca (HTx). Istnieje wiele etiologii leżących u podstaw niewydolności serca. Kardiomiopatia jest główną przyczyną HTx we wszystkich grupach wiekowych, a choroba wieńcowa jest drugą najczęstszą przyczyną u dorosłych pacjentów.

Zmiany w funkcji mitochondriów zostały uznane za kluczowe czynniki w niewydolności serca. Zrozumienie złożonej interakcji mitochondriów w regulacji metabolizmu i apoptozy komórkowej przyniosło nowe perspektywy badaniom nad niewydolnością serca. Obecnie wiadomo, że podczas niewydolności serca zmienia się gęstość mitochondriów mięśnia sercowego, a ich funkcja i integralność są upośledzone.

Podczas zabiegu przeszczepu chore serce jest usuwane, co daje niepowtarzalną możliwość pobrania próbek kwalifikujących się do dokładnego badania mitochondrialnego.

Pobrane próbki tkanki mięśnia sercowego zostaną ocenione za pomocą respirometrii wysokiej rozdzielczości, badając zdolność oddechową permeabilizowanych włókien mięśnia sercowego sprzężoną z glukozą. Pojemność oddechowa chorych włókien zostanie porównana z pojemnością oddechową włókien pochodzących od zdrowych pacjentów z chorobą wieńcową HTx, którym przeszczepiono 1 do 2 lat przed pozyskaniem włókien.

Miejmy nadzieję, że wiedza zdobyta podczas tego badania przyczyni się do ważnych spostrzeżeń dotyczących metabolizmu energetycznego chorego mięśnia sercowego. Taka wiedza może utorować drogę do opracowania terapii ukierunkowanych na dostarczanie substratów energetycznych do wytwarzania adenozynotrójfosforanu wytwarzanego przez mitochondria, jak również na funkcję mitochondriów w niewydolnym sercu.

Hipoteza:

Patologiczna funkcja mięśnia sercowego obserwowana w niewydolności serca jest związana z dysfunkcją mitochondriów serca.

Cel:

Zbadanie, czy funkcja mitochondriów serca w schyłkowej niewydolności serca o różnych etiologiach jest gorsza niż funkcja mitochondriów w przeszczepionych sercach bez oznak odrzucenia lub waskulopatii.

Projekt i punkt końcowy:

Funkcja mitochondriów mięśnia sercowego analizowana z 24 eksplantowanych serc zostanie porównana z biopsjami endomiokardialnymi od 20 pacjentów z HTx podczas zaplanowanych biopsji (1 lub 2 lata po implantacji).

Punkty końcowe: 1) Wydolność oddechowa mitochondriów. 2) Funkcja kompleksu mitochondrialnego, integralność błony zewnętrznej i zawartość mitochondriów.

Metody:

Respirometria o wysokiej rozdzielczości:

Respirometria o wysokiej rozdzielczości służy do pomiaru wydolności oddechowej mitochondriów w biopsjach endomiokardialnych. Po odpowiednim przygotowaniu dwie biopsje przenosi się do oksygrafu (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Austria) w celu przeprowadzenia respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Wydolność oddechowa mitochondriów będzie analizowana krok po kroku za pomocą miareczkowania substratów i inhibitorów w celu oceny oddychania sprzężonego z glukozą we włóknach. Analiza respirometryczna o wysokiej rozdzielczości jest wykonywana w ciągu 8 godzin po pobraniu biopsji.

Po analizie tkanka zostanie szybko zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w biobanku badawczym w -80 stopniach Celsjusza do czasu zbadania aktywności syntazy cytrynianowej. Odtąd wszelkie pozostałe tkanki zostaną zniszczone.

Mikroskopia elektronowa:

Próbka z każdej biopsji użytej do respirometrii o wysokiej rozdzielczości zostanie wykorzystana do mikroskopii elektronowej (EM) w celu oceny gęstości objętościowej mitochondriów (MitoVD) i integralności. Próbki mięśni utrwala się przez 24 godziny w aldehydzie glutarowym i przemywa 4 x 15 minut buforem Na-kakodylanowym przed odlaniem w Eponie. Odlana tkanka z Eponu będzie przechowywana w biobanku badawczym do czasu analizy EM. Ultracienkie skrawki bloków Epon (60 nm) są cięte na trzy głębokości i barwione octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Obrazowanie przeprowadza się za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego EM 208 i kamery Megaview III. Wszystkie włókna są fotografowane przy powiększeniu 10 000 × w przypadkowej kolejności. MitoVD szacuje się na podstawie powierzchni ułamkowej mitochondriów iw końcowej analizie zostaną użyte tylko odrębne włókna.

Statystyka:

Dane o rozkładzie normalnym zostaną przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe; dane o rozkładzie innym niż normalny zostaną przedstawione jako mediana i rozstęp międzykwartylowy. Dane kategoryczne prezentowane są w postaci wartości bezwzględnych lub procentowych. Histogramy i wykresy Q-Q zostaną użyte do sprawdzenia normalności ciągłych wartości. Różnice między grupami zostaną ocenione za pomocą testu t dla danych o rozkładzie normalnym i testu U Manna-Whitneya dla danych o rozkładzie innym niż normalny. Istotność statystyczna przy wartości p <0,05.

Obliczenie wielkości próbki:

Obecnie nie ma oceny test-retest mitochondrialnej analizy oddechowej w biopsjach endomiokardialnych z eksplantowanych ludzkich serc. Jednak niedawne badanie przeprowadzone w naszym oddziale na temat biopsji mięśnia sercowego wykazało, że całkowita wielkość próby 40 osób w układzie grup równoległych 1: 1 była w stanie zidentyfikować różnice między dwiema grupami (dane niepublikowane).

Gromadzenie i przetwarzanie danych:

Dane źródłowe zostaną zapisane w elektronicznej karcie pacjenta lub na specjalnych kartach pracy.

Scentralizowany elektroniczny formularz zgłoszenia przypadku (CRF) zostanie skonstruowany w celu gromadzenia danych. Dane będą przechowywane do czasu zakończenia projektu, po czym zostaną przekazane do Duńskiego Archiwum Danych.

Perspektywy:

HTx jest złotym standardem leczenia pacjentów ze schyłkową niewydolnością serca, ale nie można ignorować jej ograniczeń. Po pierwsze, zabiegowi towarzyszy duże ryzyko, a znaczny odsetek pacjentów cierpi na ostrą niewydolność przeszczepu. Ponadto pacjenci z HTx są bardziej narażeni na ciężkie infekcje i raka, a nawet 50% pacjentów z HTx cierpi na waskulopatię alloprzeszczepu serca 10 lat po przeszczepie, z których wszystkie są silnie związane ze śmiertelnością. Stąd odroczenie HTx jest pożądane, jeśli zdrowie i jakość życia mogą być utrzymane na akceptowalnym poziomie. W tym kontekście funkcja mitochondriów wydaje się mieć kluczowe znaczenie, ponieważ podejście do oceny funkcji mitochondriów w niewydolnym sercu może utorować drogę nowym algorytmom obserwacji, a nawet celom leczenia.