Hjärtmitokondriell funktion i explanterade mänskliga hjärtan

Bakgrund:

Behandlingen av hjärtsvikt har förbättrats avsevärt under de senaste decennierna. Trots denna förbättring kan sjukdomen utvecklas till ett slutskede och i slutändan lämnar läkarna inget annat behandlingsalternativ än hjärttransplantation (HTx). Det finns flera etiologier bakom hjärtsvikt. Kardiomyopati är den främsta orsaken till HTx i alla åldersgrupper med kranskärlssjukdom som den näst vanligaste orsaken hos vuxna patienter.

Förändringar i mitokondriernas funktion har erkänts som nyckelfaktorer vid hjärtsvikt. Förståelsen av mitokondriernas komplexa växelverkan vid reglering av ämnesomsättningen och cellulär apoptos har gett nya perspektiv till forskningen inom hjärtsvikt. Det är nu känt att myokardiets mitokondriella täthet förändras och deras funktion och integritet försämras vid hjärtsvikt.

Under transplantationsproceduren avlägsnas det sjuka hjärtat, vilket ger en unik möjlighet att samla in prover som är kvalificerade för grundlig mitokondriell undersökning.

De insamlade myokardvävnadsproverna kommer att utvärderas med högupplösande respirometri, som undersöker den glukoskopplade andningskapaciteten hos permeabiliserade myokardfibrer. Andningskapaciteten i de sjuka fibrerna kommer att jämföras med andningskapaciteten i fibrer från kranskärlsfriska HTx-patienter transplanterade 1 till 2 år före förvärvet av fibrerna.

Förhoppningsvis kommer kunskapen från denna undersökning att bidra med viktiga insikter i den sjuka energiomsättningen i hjärtmuskeln. Sådan kunskap kan bana väg för utveckling av behandlingar inriktade på energisubstratförsörjning för generering av adenosintrifosfat producerad av mitokondrierna såväl som mitokondriell funktion i det sviktande hjärtat.

Hypotes:

Den patologiska myokardfunktionen som ses vid hjärtsvikt är relaterad till dysfunktionella hjärtmitokondrier.

Mål:

Att undersöka om hjärtmitokondriell funktion i slutstadiet av hjärtsvikt av flera etiologier är sämre än mitokondriell funktion i transplanterade hjärtan utan tecken på avstötning eller vaskulopati.

Design och slutpunkt:

Myokardial mitokondriell funktion analyserad från 24 explanterade hjärtan kommer att jämföras med endomyokardiella biopsier från 20 HTx-patienter vid schemalagda biopsier (1 eller 2 år efter implantation).

Endpoints: 1) Mitokondriell andningskapacitet. 2) Mitokondriekomplexfunktion, yttre membranintegritet och mitokondrieinnehåll.

Metoder:

Högupplöst respirometri:

Högupplöst respirometri används för att mäta mitokondriell andningskapacitet i endomyokardiella biopsier. Efter lämplig förberedelse överförs två biopsier till en oxygraph (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Österrike) för högupplöst respirometri. Mitokondriell andningskapacitet kommer att analyseras steg-för-steg med hjälp av titrering av substrat och inhibitorer för att utvärdera glukoskopplad andning i fibrerna. Högupplöst respirometrianalys utförs inom 8 timmar efter att biopsi har tagits.

Efter analys kommer vävnaden att snabbfrysas i flytande kväve och lagras i en forskningsbiobank vid -80 grader celsius tills undersökning av citratsyntasaktivitet utförs. Härefter kommer all kvarvarande vävnad att förstöras.

Elektronmikroskopi:

Ett prov från varje biopsi som används för högupplöst respirometri kommer att användas för elektronmikroskopi (EM) för att utvärdera mitokondriell volymdensitet (MitoVD) och integritet. Muskelprover fixeras i 24 timmar i glutaraldehyd och tvättas 4x15 minuter med Na-kakodylatbuffert innan de gjuts i Epon. Den Epon-gjutna vävnaden kommer att lagras i en forskningsbiobank fram till EM-analys. Ultratunna sektioner av Epon-blocken (60 nm) skärs i tre djup och färgas med uranylacetat och blycitrat. Avbildning utförs med ett EM 208 transmissionselektronmikroskop och en Megaview III-kamera. Alla fibrer fotograferas med 10 000 × förstoring i randomiserad ordning. MitoVD uppskattas från mitokondriella fraktionerade area och endast distinkta fibrer kommer att användas i den slutliga analysen.

Statistik:

Normalfördelade data kommer att presenteras som medelvärde ± standardavvikelse; icke-normalfördelade data kommer att presenteras som median- och interkvartilintervall. Kategoriska data presenteras som absoluta värden eller procentsatser. Histogram och Q-Q plots kommer att användas för att kontrollera kontinuerliga värden för normalitet. Skillnader mellan grupper kommer att bedömas med t-test för normalfördelade data och Mann-Whitney U-test för icke-normalfördelade data. Statistisk signifikans vid ett p-värde på <0,05.

Provstorleksberäkning:

För närvarande finns det ingen test-retest utvärdering av mitokondriell respiratorisk analys i endomyokardiella biopsier från explanterade mänskliga hjärtan. En nyligen genomförd studie utförd på vår avdelning på myokardbiopsier visade dock att en total provstorlek på 40 mänskliga försökspersoner i en 1:1 parallell gruppdesign kunde identifiera skillnader mellan de två grupperna (opublicerade data).

Datainsamling och bearbetning:

Källdata kommer att registreras i patientens elektroniska patientjournal eller på specifika arbetsblad.

Ett centraliserat elektroniskt fallrapportformulär (CRF) kommer att konstrueras för datafångst. Data kommer att lagras tills projektet är slutfört, varefter det kommer att överföras till det danska dataarkivet.

Perspektiv:

HTx är den gyllene standardbehandlingen för patienter som lider av hjärtsvikt i slutstadiet, men dess begränsningar kan inte ignoreras. För det första är proceduren åtföljd av en betydande risk och en betydande andel av patienterna lider av akut transplantatsvikt. Vidare har HTx-patienter en högre risk för svåra infektioner och cancer, och upp till 50 % av HTx-patienterna lider av kardial allograft vaskulopati 10 år efter transplantationen, som alla är starkt relaterade till dödlighet. Att skjuta upp HTx är därför önskvärt om hälsa och livskvalitet kan hållas på en acceptabel nivå. I detta sammanhang verkar mitokondriell funktion vara avgörande, eftersom metoder för att bedöma mitokondriell funktion i det sviktande hjärtat kan visa sig bana väg för nya uppföljningsalgoritmer och till och med behandlingsmål.