Función mitocondrial cardíaca en corazones humanos explantados

Fondo:

El tratamiento de la insuficiencia cardíaca ha mejorado considerablemente en las últimas décadas. A pesar de esta mejora, la enfermedad puede progresar a una etapa final que finalmente deje a los médicos sin otra opción de tratamiento que el trasplante de corazón (HTx). Hay múltiples etiologías subyacentes a la insuficiencia cardíaca. La miocardiopatía es la principal causa de HTx en cualquier grupo de edad, siendo la enfermedad de las arterias coronarias la segunda causa más común en pacientes adultos.

Las alteraciones en la función mitocondrial han sido reconocidas como factores clave en la insuficiencia cardiaca. La comprensión de la compleja interacción de las mitocondrias en la regulación del metabolismo y la apoptosis celular ha aportado nuevas perspectivas a la investigación en insuficiencia cardiaca. Ahora se sabe que la densidad mitocondrial del miocardio cambia y su función e integridad se deterioran durante la insuficiencia cardíaca.

Durante el procedimiento de trasplante, se extrae el corazón enfermo, lo que brinda una oportunidad única para recolectar muestras elegibles para un examen mitocondrial completo.

Las muestras de tejido miocárdico recolectadas se evaluarán con respirometría de alta resolución, examinando la capacidad respiratoria acoplada a la glucosa de las fibras miocárdicas permeabilizadas. La capacidad respiratoria de las fibras enfermas se comparará con la capacidad respiratoria de las fibras de pacientes coronarios sanos con TxC trasplantados 1 o 2 años antes de la adquisición de las fibras.

Con suerte, el conocimiento obtenido de esta investigación contribuirá con información importante sobre el metabolismo energético del miocardio enfermo. Dicho conocimiento puede allanar el camino para el desarrollo de tratamientos dirigidos al suministro de sustratos energéticos para la generación de trifosfato de adenosina producido por las mitocondrias, así como la función mitocondrial en el corazón defectuoso.

Hipótesis:

La función miocárdica patológica que se observa en la insuficiencia cardíaca está relacionada con mitocondrias cardíacas disfuncionales.

Objetivo:

Examinar si la función mitocondrial cardíaca en insuficiencia cardíaca terminal de múltiples etiologías es inferior a la función mitocondrial en corazones trasplantados sin signos de rechazo o vasculopatía.

Diseño y punto final:

La función mitocondrial miocárdica analizada de 24 corazones explantados se comparará con las biopsias endomiocárdicas de 20 pacientes con HTx en biopsias programadas (1 o 2 años después del implante).

Criterios de valoración: 1) Capacidad respiratoria mitocondrial. 2) Función del complejo mitocondrial, integridad de la membrana externa y contenido mitocondrial.

Métodos:

Respirometría de alta resolución:

La respirometría de alta resolución se utiliza para medir la capacidad respiratoria mitocondrial en biopsias endomiocárdicas. Después de la preparación adecuada, se transfieren dos biopsias a un oxímetro (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Austria) para una respirometría de alta resolución. La capacidad respiratoria mitocondrial se analizará paso a paso usando titulaciones de sustratos e inhibidores para evaluar la respiración acoplada a la glucosa en las fibras. El análisis de respirometría de alta resolución se realiza dentro de las 8 horas posteriores a la toma de la biopsia.

Después del análisis, el tejido se congelará instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenará en un biobanco de investigación a -80 grados centígrados hasta que se lleve a cabo el examen de la actividad de la citrato sintasa. De ahora en adelante, cualquier tejido restante será destruido.

Microscopio de electrones:

Una muestra de cada biopsia utilizada para la respirometría de alta resolución se utilizará para microscopía electrónica (EM) para evaluar la densidad de volumen mitocondrial (MitoVD) y la integridad. Las muestras de músculo se fijan durante 24 horas en glutaraldehído y se lavan 4x15 minutos con tampón de cacodilato de sodio antes de colarse en Epon. El tejido moldeado con Epon se almacenará en un biobanco de investigación hasta el análisis EM. Se cortan secciones ultrafinas de los bloques Epon (60 nm) en tres profundidades y se tiñen con acetato de uranilo y citrato de plomo. La formación de imágenes se realiza con un microscopio electrónico de transmisión EM 208 y una cámara Megaview III. Todas las fibras se fotografían con un aumento de 10.000 × en un orden aleatorio. MitoVD se estima a partir del área fraccional mitocondrial y solo se utilizarán fibras distintas en el análisis final.

Estadísticas:

Los datos normalmente distribuidos se presentarán como media ± desviación estándar; los datos que no se distribuyen normalmente se presentarán como mediana y rango intercuartílico. Los datos categóricos se presentan como valores absolutos o porcentajes. Se utilizarán histogramas y gráficos Q-Q para comprobar la normalidad de los valores continuos. Las diferencias entre grupos se evaluarán mediante la prueba t para datos con distribución normal y la prueba U de Mann-Whitney para datos con distribución no normal. Significación estadística a un valor de p <0,05.

Cálculo del tamaño de la muestra:

En la actualidad no existe una evaluación test-retest del análisis respiratorio mitocondrial en biopsias endomiocárdicas de corazones humanos explantados. Sin embargo, un estudio reciente realizado en nuestro departamento sobre biopsias de miocardio demostró que un tamaño de muestra total de 40 sujetos humanos en un diseño de grupo paralelo 1:1 pudo identificar diferencias entre los dos grupos (datos no publicados).

Recopilación y procesamiento de datos:

Los datos de origen se registrarán en la historia clínica electrónica del paciente o en hojas de trabajo específicas.

Se construirá un formulario electrónico centralizado de informe de casos (CRF) para la captura de datos. Los datos se almacenarán hasta la finalización del proyecto, después de lo cual se transmitirán a los archivos de datos daneses.

Perspectivas:

HTx es el tratamiento estándar de oro para pacientes que sufren insuficiencia cardíaca terminal, pero no se pueden ignorar sus limitaciones. En primer lugar, el procedimiento conlleva un riesgo importante y un porcentaje importante de pacientes sufre un fallo agudo del injerto. Además, los pacientes con TxC tienen un mayor riesgo de infecciones graves y cáncer, y hasta el 50% de los pacientes con TxC sufren vasculopatía del aloinjerto cardíaco 10 años después del trasplante, todo lo cual está muy relacionado con la mortalidad. Por lo tanto, es deseable posponer el TxC, si la salud y la calidad de vida se pueden mantener en un nivel aceptable. En este contexto, la función mitocondrial parece ser fundamental, ya que los enfoques para evaluar la función mitocondrial en el corazón defectuoso pueden allanar el camino para nuevos algoritmos de seguimiento e incluso objetivos de tratamiento.