Sydämen mitokondrioiden toiminta eksplantoiduissa ihmissydämissä

Tausta:

Sydämen vajaatoiminnan hoito on parantunut huomattavasti viime vuosikymmeninä. Tästä paranemisesta huolimatta tauti voi edetä loppuvaiheeseen, jolloin lääkäreillä ei ole muuta hoitovaihtoehtoa kuin sydämensiirto (HTx). Sydämen vajaatoiminnan taustalla on useita syitä. Kardiomyopatia on johtava HTx:n syy kaikissa ikäryhmissä, ja sepelvaltimotauti on toiseksi yleisin syy aikuispotilailla.

Muutokset mitokondrioiden toiminnassa on tunnustettu avaintekijöiksi sydämen vajaatoiminnassa. Mitokondrioiden monimutkaisen vuorovaikutuksen ymmärtäminen aineenvaihdunnan ja solujen apoptoosin säätelyssä on tuonut uusia näkökulmia sydämen vajaatoiminnan tutkimukseen. Nyt tiedetään, että sydänlihaksen mitokondrioiden tiheys muuttuu ja niiden toiminta ja eheys heikkenevät sydämen vajaatoiminnan aikana.

Elinsiirtotoimenpiteen aikana sairas sydän poistetaan, mikä tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden kerätä näytteitä perusteelliseen mitokondriotutkimukseen.

Kerätyt sydänlihaskudosnäytteet arvioidaan korkearesoluutioisella respirometrialla, jossa tutkitaan permeabilisoitujen sydänlihaskuitujen glukoosikytkentäkykyä. Hengityskapasiteettia sairaissa kuiduissa verrataan kuitujen hengityskapasiteettiin sepelvaltimon terveiltä HTx-potilailta, jotka on siirretty 1-2 vuotta ennen kuitujen hankintaa.

Toivottavasti tästä tutkimuksesta saadut tiedot auttavat saamaan tärkeitä näkemyksiä sairaan sydänlihaksen energia-aineenvaihdunnasta. Tällainen tieto voi valmistaa tietä sellaisten hoitojen kehittämiselle, jotka kohdistuvat energiasubstraattien saantiin mitokondrioiden tuottamaa adenosiini-trifosfaatin muodostumista varten sekä mitokondrioiden toimintaan vajaatoiminnassa.

Hypoteesi:

Sydämen vajaatoiminnassa havaittu patologinen sydänlihaksen toiminta liittyy toimintahäiriöihin sydämen mitokondrioissa.

Tavoite:

Tutkia, onko sydämen mitokondrioiden toiminta loppuvaiheen sydämen vajaatoiminnassa useissa eri etiologioissa huonompi kuin mitokondrioiden toiminta siirretyissä sydämissä, joissa ei ole merkkejä hyljinnästä tai vaskulopatiasta.

Suunnittelu ja päätepiste:

Sydänlihaksen mitokondrioiden toimintaa, joka on analysoitu 24:stä eksplantoidusta sydämestä, verrataan endomyokardiaalisiin biopsioihin 20 HTx-potilaalta aikataulun mukaisissa biopsioissa (1 tai 2 vuotta implantoinnin jälkeen).

Päätepisteet: 1) Mitokondrioiden hengityskapasiteetti. 2) Mitokondrioiden kompleksitoiminta, ulkokalvon eheys ja mitokondrioiden sisältö.

Menetelmät:

Korkean resoluution respirometria:

Korkean resoluution respirometriaa käytetään mitokondrioiden hengityskapasiteetin mittaamiseen endomyokardiaalisissa biopsioissa. Sopivan valmistelun jälkeen kaksi biopsiaa siirretään oksigrafiin (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Itävalta) korkearesoluutioista respirometriaa varten. Mitokondrioiden hengityskapasiteettia analysoidaan vaiheittain käyttämällä substraattien ja inhibiittoreiden titrauksia glukoosiin kytketyn hengityksen arvioimiseksi kuiduissa. Korkearesoluutioinen respirometria-analyysi suoritetaan 8 tunnin sisällä biopsian otosta.

Analyysin jälkeen kudos pikapakastetaan nestetypessä ja säilytetään tutkimusbiopankissa -80 celsiusasteessa, kunnes sitraattisyntaasiaktiivisuus on tutkittu. Tämän jälkeen kaikki jäljellä oleva kudos tuhotaan.

Elektronimikroskopia:

Jokaisesta korkearesoluutioiseen respirometriaan käytetystä biopsiasta otettua näytettä käytetään elektronimikroskopiaan (EM) mitokondrioiden tilavuustiheyden (MitoVD) ja eheyden arvioimiseksi. Lihasnäytteitä kiinnitetään 24 tunnin ajan glutaraldehydissä ja pestään 4 x 15 minuuttia Na-kakodylaattipuskurilla ennen valettua Eponiin. Epon-valettu kudos säilytetään tutkimusbiopankissa EM-analyysiin asti. Ultraohuet osat Epon-lohkoista (60 nm) leikataan kolmeen syvyyteen ja värjätään uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla. Kuvaus suoritetaan EM 208 transmissioelektronimikroskoopilla ja Megaview III -kameralla. Kaikki kuidut valokuvataan 10 000-kertaisella suurennuksella satunnaisessa järjestyksessä. MitoVD on arvioitu mitokondrioiden murto-alasta ja loppuanalyysissä käytetään vain erillisiä kuituja.

Tilastot:

Normaalisti jakautuneet tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonna; ei-normaalisti jakautuneet tiedot esitetään mediaani- ja kvartiilivälinä. Kategoriset tiedot esitetään absoluuttisina arvoina tai prosentteina. Histogrammeja ja Q-Q-kaavioita käytetään jatkuvien arvojen normaaliuden tarkistamiseen. Ryhmien väliset erot arvioidaan t-testillä normaalijakautuneille tiedoille ja Mann-Whitney U -testillä ei-normaalijakautuneille tiedoille. Tilastollinen merkitsevyys p-arvolla <0,05.

Näytteen kokolaskenta:

Tällä hetkellä ei ole olemassa testi-uudelleentestausarviointia mitokondrioiden hengitysanalyysistä endomyokardiaalisista biopsioista, jotka on otettu siirretyistä ihmissydämistä. Hiljattain osastollamme tehty sydänlihasbiopsiatutkimus osoitti kuitenkin, että 40 ihmisen kokonaisotoskoko 1:1 rinnakkaisryhmäsuunnitelmassa pystyi tunnistamaan erot näiden kahden ryhmän välillä (julkaisematon data).

Tiedonkeruu ja käsittely:

Lähdetiedot tallennetaan potilaan sähköiseen potilastietokirjaan tai tietyille työarkeille.

Tietojen keräämistä varten rakennetaan keskitetty sähköinen tapausraporttilomake (CRF). Tietoja säilytetään projektin valmistumiseen saakka, jonka jälkeen ne siirretään Tanskan tietoarkistoon.

Näkökulmat:

HTx on kultainen standardi hoito potilaille, jotka kärsivät loppuvaiheen sydämen vajaatoiminnasta, mutta sen rajoituksia ei voida jättää huomiotta. Ensinnäkin toimenpiteeseen liittyy huomattava riski, ja merkittävä osa potilaista kärsii akuutista siirteen vajaatoiminnasta. Lisäksi HTx-potilailla on suurempi riski sairastua vakaviin infektioihin ja syöpään, ja jopa 50 % HTx-potilaista kärsii sydämen allograftin vaskulopatiasta 10 vuotta transplantaation jälkeen, jotka kaikki liittyvät voimakkaasti kuolleisuuteen. Siksi HTx:n lykkääminen on toivottavaa, jos terveys ja elämänlaatu voidaan pitää hyväksyttävällä tasolla. Tässä yhteydessä mitokondrioiden toiminta näyttää olevan keskeinen, koska lähestymistavat mitokondrioiden toiminnan arvioimiseksi vajaatoiminnassa voivat osoittautua tasoittavan tietä uusille seurantaalgoritmeille ja jopa hoitokohteille.