Cardiale mitochondriale functie in geëxplanteerde menselijke harten

Achtergrond:

De behandeling van hartfalen is de afgelopen decennia sterk verbeterd. Ondanks deze verbetering kan de ziekte zich ontwikkelen tot een eindstadium, waardoor de artsen uiteindelijk geen andere behandelingsoptie meer hebben dan harttransplantatie (HTx). Er zijn meerdere etiologieën die ten grondslag liggen aan hartfalen. Cardiomyopathie is de belangrijkste oorzaak van HTx in elke leeftijdsgroep, waarbij coronaire hartziekte de tweede meest voorkomende oorzaak is bij volwassen patiënten.

Veranderingen in de mitochondriale functie zijn erkend als sleutelfactoren bij hartfalen. Het begrip van de complexe interactie van de mitochondriën bij de regulatie van het metabolisme en cellulaire apoptose heeft nieuwe perspectieven gebracht voor onderzoek naar hartfalen. Het is nu bekend dat de myocardiale mitochondriale densiteit verandert en dat hun functie en integriteit wordt aangetast tijdens hartfalen.

Tijdens de transplantatieprocedure wordt het zieke hart verwijderd, wat een unieke gelegenheid biedt om monsters te verzamelen die in aanmerking komen voor grondig mitochondriaal onderzoek.

De verzamelde myocardweefselmonsters zullen worden geëvalueerd met High Resolution Respirometry, waarbij de glucosegekoppelde ademhalingscapaciteit van permeabel gemaakte myocardvezels wordt onderzocht. De respiratoire capaciteit in de zieke vezels zal worden vergeleken met de respiratoire capaciteit in vezels van coronaire gezonde HTx-patiënten die 1 tot 2 jaar voorafgaand aan de verwerving van de vezels zijn getransplanteerd.

Hopelijk zal de kennis die uit dit onderzoek is opgedaan bijdragen aan belangrijke inzichten in het zieke myocardiale energiemetabolisme. Dergelijke kennis kan de weg vrijmaken voor de ontwikkeling van behandelingen die gericht zijn op de levering van energiesubstraten voor de aanmaak van adenosine-trifosfaat geproduceerd door de mitochondriën, evenals de mitochondriale functie in het falende hart.

Hypothese:

De pathologische myocardfunctie die wordt gezien bij hartfalen houdt verband met disfunctionele cardiale mitochondriën.

Objectief:

Om te onderzoeken of de cardiale mitochondriale functie bij eindstadium hartfalen van meerdere etiologieën inferieur is aan de mitochondriale functie in getransplanteerde harten zonder tekenen van afstoting of vasculopathie.

Ontwerp en eindpunt:

Myocardiale mitochondriale functie geanalyseerd van 24 geëxplanteerde harten zal worden vergeleken met endomyocardiale biopsieën van 20 HTx-patiënten bij geplande biopsieën (1 of 2 jaar na implantatie).

Eindpunten: 1) Mitochondriale ademhalingscapaciteit. 2) Mitochondriale complexe functie, integriteit van buitenmembraan en mitochondriale inhoud.

methoden:

Ademhalingsmeting met hoge resolutie:

Respirometrie met hoge resolutie wordt gebruikt om de mitochondriale ademhalingscapaciteit te meten in endomyocardiale biopsieën. Na de juiste voorbereiding worden twee biopsieën overgebracht naar een oxygraaf (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Oostenrijk) voor respirometrie met hoge resolutie. De mitochondriale ademhalingscapaciteit zal stapsgewijs worden geanalyseerd met behulp van titraties van substraten en remmers om de glucosegekoppelde ademhaling in de vezels te evalueren. Hoge resolutie respirometrie-analyse wordt uitgevoerd binnen 8 uur nadat de biopsie is genomen.

Na analyse wordt het weefsel snel ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen in een onderzoeksbiobank bij -80 graden Celsius totdat de citraatsynthase-activiteit is onderzocht. Hierna wordt eventueel achtergebleven weefsel vernietigd.

Elektronenmicroscopie:

Een monster van elke biopsie die wordt gebruikt voor respirometrie met hoge resolutie zal worden gebruikt voor elektronenmicroscopie (EM) om de mitochondriale volumedichtheid (MitoVD) en integriteit te evalueren. Spiermonsters worden 24 uur gefixeerd in glutaaraldehyde en 4 x 15 minuten gewassen met Na-cacodylaatbuffer voordat ze in Epon worden gegoten. Het met Epon gegoten weefsel wordt opgeslagen in een onderzoeksbiobank tot EM-analyse. Ultradunne secties van de Epon-blokken (60 nm) worden in drie dieptes gesneden en geverfd met uranylacetaat en loodcitraat. Beeldvorming wordt uitgevoerd met een EM 208 transmissie-elektronenmicroscoop en een Megaview III-camera. Alle vezels zijn gefotografeerd met een vergroting van 10.000 x in willekeurige volgorde. MitoVD wordt geschat op basis van het mitochondriale fractionele gebied en alleen afzonderlijke vezels zullen worden gebruikt in de uiteindelijke analyse.

Statistieken:

Normaal verdeelde gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie; niet-normaal verdeelde gegevens worden gepresenteerd als mediaan en interkwartielbereik. Categorische gegevens worden gepresenteerd als absolute waarden of percentages. Histogrammen en Q-Q-plots worden gebruikt om continue waarden op normaliteit te controleren. Verschillen tussen groepen zullen worden beoordeeld door middel van een t-toets voor normaal verdeelde gegevens en een Mann-Whitney U-toets voor niet-normaal verdeelde gegevens. Statistische significantie bij een p-waarde van <0,05.

Berekening van de steekproefomvang:

Momenteel zijn er geen test-hertestevaluaties van mitochondriale respiratoire analyse in endomyocardiale biopsieën van geëxplanteerde menselijke harten. Een recent onderzoek uitgevoerd op onze afdeling naar myocardiale biopsieën toonde echter aan dat een totale steekproefomvang van 40 proefpersonen in een 1:1 parallelle groepsopzet verschillen tussen de twee groepen kon identificeren (niet-gepubliceerde gegevens).

Gegevensverzameling en -verwerking:

Brongegevens worden vastgelegd in het elektronisch patiëntendossier van de patiënt of op specifieke werkbladen.

Er zal een gecentraliseerd elektronisch Case Report Form (CRF) worden gebouwd voor het vastleggen van gegevens. De gegevens worden bewaard tot de voltooiing van het project, waarna ze worden verzonden naar het Deense gegevensarchief.

Perspectieven:

HTx is de gouden standaardbehandeling voor patiënten met eindstadium hartfalen, maar de beperkingen ervan kunnen niet worden genegeerd. Ten eerste gaat de procedure gepaard met een aanzienlijk risico en lijdt een aanzienlijk percentage van de patiënten aan acuut transplantaatfalen. Bovendien hebben HTx-patiënten een hoger risico op ernstige infecties en kanker, en lijdt tot 50% van de HTx-patiënten 10 jaar na transplantatie aan harttransplantaatvasculopathie, die allemaal sterk gerelateerd zijn aan mortaliteit. Het uitstellen van HTx is daarom wenselijk, als gezondheid en levenskwaliteit op een acceptabel niveau kunnen worden gehouden. In deze context lijkt de mitochondriale functie cruciaal te zijn, aangezien benaderingen om de mitochondriale functie in het falende hart te beoordelen, de weg kunnen effenen voor nieuwe vervolgalgoritmen en zelfs behandelingsdoelen.