Função mitocondrial cardíaca em corações humanos explantados

Fundo:

O tratamento da insuficiência cardíaca melhorou consideravelmente nas últimas décadas. Apesar dessa melhora, a doença pode progredir para um estágio final, deixando os médicos sem outra opção de tratamento além do transplante de coração (HTx). Existem múltiplas etiologias subjacentes à insuficiência cardíaca. A cardiomiopatia é a principal causa de HTx em qualquer faixa etária, sendo a doença arterial coronariana a segunda causa mais comum em pacientes adultos.

Alterações na função mitocondrial têm sido reconhecidas como fatores-chave na insuficiência cardíaca. A compreensão da complexa interação das mitocôndrias na regulação do metabolismo e apoptose celular trouxe novas perspectivas para a pesquisa em insuficiência cardíaca. Sabe-se agora que a densidade mitocondrial do miocárdio muda e sua função e integridade são prejudicadas durante a insuficiência cardíaca.

Durante o procedimento de transplante, o coração doente é removido, proporcionando uma oportunidade única de coletar amostras elegíveis para exame mitocondrial completo.

As amostras de tecido miocárdico coletadas serão avaliadas com Respirometria de Alta Resolução, examinando a capacidade respiratória acoplada à glicose das fibras miocárdicas permeabilizadas. A capacidade respiratória nas fibras doentes será comparada com a capacidade respiratória em fibras de pacientes com HTx coronarianos saudáveis ​​transplantados 1 a 2 anos antes da aquisição das fibras.

Esperançosamente, o conhecimento adquirido com esta investigação contribuirá com informações importantes sobre o metabolismo energético do miocárdio doente. Tal conhecimento pode abrir caminho para o desenvolvimento de tratamentos visando o fornecimento de substrato energético para a geração de adenosina-trifosfato produzida pelas mitocôndrias, bem como a função mitocondrial no coração com insuficiência.

Hipótese:

A função miocárdica patológica observada na insuficiência cardíaca está relacionada a mitocôndrias cardíacas disfuncionais.

Objetivo:

Examinar se a função mitocondrial cardíaca na insuficiência cardíaca terminal de múltiplas etiologias é inferior à função mitocondrial em corações transplantados sem sinais de rejeição ou vasculopatia.

Projeto e ponto final:

A função mitocondrial miocárdica analisada de 24 corações explantados será comparada com biópsias endomiocárdicas de 20 pacientes com HTx em biópsias agendadas (1 ou 2 anos após o implante).

Pontos finais: 1) Capacidade respiratória mitocondrial. 2) Função do complexo mitocondrial, integridade da membrana externa e conteúdo mitocondrial.

Métodos:

Respirometria de alta resolução:

A respirometria de alta resolução é usada para medir a capacidade respiratória mitocondrial em biópsias endomiocárdicas. Após preparo adequado, duas biópsias são transferidas para um oxígrafo (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Áustria) para respirometria de alta resolução. A capacidade respiratória mitocondrial será analisada passo a passo usando titulações de substratos e inibidores para avaliar a respiração acoplada à glicose nas fibras. A análise da respirometria de alta resolução é realizada dentro de 8 horas após a realização da biópsia.

Após a análise, o tecido será congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado em um biobanco de pesquisa a -80 graus Celsius até que seja realizado o exame da atividade da citrato sintase. Daqui em diante, qualquer tecido restante será destruído.

Microscópio eletrônico:

Uma amostra de cada biópsia usada para respirometria de alta resolução será usada para microscopia eletrônica (ME) para avaliar a densidade do volume mitocondrial (MitoVD) e integridade. As amostras de músculo são fixadas por 24 horas em glutaraldeído e lavadas 4x15 minutos com tampão Na-cacodilato antes de serem fundidas em Epon. O tecido fundido Epon será armazenado em um biobanco de pesquisa até a análise EM. Seções ultrafinas dos blocos Epon (60 nm) são cortadas em três profundidades e tingidas com acetato de uranila e citrato de chumbo. A imagem é realizada com um microscópio eletrônico de transmissão EM 208 e uma câmera Megaview III. Todas as fibras são fotografadas com ampliação de 10.000 × em ordem aleatória. MitoVD é estimado a partir da área fracionada mitocondrial e apenas fibras distintas serão utilizadas na análise final.

Estatisticas:

Dados normalmente distribuídos serão apresentados como média ± desvio padrão; dados não normalmente distribuídos serão apresentados como mediana e intervalo interquartílico. Os dados categóricos são apresentados como valores absolutos ou porcentagens. Histogramas e gráficos Q-Q serão usados ​​para verificar a normalidade dos valores contínuos. As diferenças entre os grupos serão avaliadas pelo teste t para dados normalmente distribuídos e pelo teste U de Mann-Whitney para dados não normalmente distribuídos. Significância estatística a um valor p <0,05.

Cálculo do tamanho da amostra:

Atualmente, não há avaliação teste-reteste da análise respiratória mitocondrial em biópsias endomiocárdicas de corações humanos explantados. No entanto, um estudo recente realizado em nosso departamento sobre biópsias miocárdicas demonstrou que uma amostra total de 40 seres humanos em um desenho de grupo paralelo 1:1 foi capaz de identificar diferenças entre os dois grupos (dados não publicados).

Coleta e processamento de dados:

Os dados de origem serão registrados no prontuário eletrônico do paciente ou em planilhas específicas.

Um Formulário de Relato de Caso (CRF) eletrônico centralizado será construído para coleta de dados. Os dados serão armazenados até a conclusão do projeto, após o que serão transmitidos aos arquivos de dados dinamarqueses.

Perspectivas:

A HTx é o tratamento padrão ouro para pacientes que sofrem de insuficiência cardíaca terminal, mas suas limitações não podem ser ignoradas. Em primeiro lugar, o procedimento é acompanhado por um risco substancial e uma porcentagem significativa de pacientes sofre de falência aguda do enxerto. Além disso, os pacientes com HTx têm maior risco de infecções graves e câncer, e até 50% dos pacientes com HTx sofrem de vasculopatia do enxerto cardíaco 10 anos após o transplante, todos altamente relacionados à mortalidade. Assim, o adiamento da Tx é desejável, se a saúde e a qualidade de vida puderem ser mantidas em um nível aceitável. Nesse contexto, a função mitocondrial parece ser fundamental, pois as abordagens para avaliar a função mitocondrial no coração com insuficiência podem abrir caminho para novos algoritmos de acompanhamento e até alvos de tratamento.