Hjerte mitokondriell funksjon i eksplanterte menneskelige hjerter

Bakgrunn:

Behandling av hjertesvikt har forbedret seg betraktelig de siste tiårene. Til tross for denne forbedringen, kan sykdommen utvikle seg til et sluttstadium og til slutt etterlate legene uten andre behandlingsalternativer enn hjertetransplantasjon (HTx). Det er flere etiologier som ligger til grunn for hjertesvikt. Kardiomyopati er den ledende årsaken til HTx i alle aldersgrupper med koronarsykdom som den nest vanligste årsaken hos voksne pasienter.

Endringer i mitokondriefunksjonen har blitt anerkjent som nøkkelfaktorer ved hjertesvikt. Forståelsen av det komplekse samspillet mellom mitokondriene i regulering av metabolismen og cellulær apoptose har brakt nye perspektiver til forskning på hjertesvikt. Det er nå kjent at myokardiets mitokondrielle tetthet endres og deres funksjon og integritet blir svekket under hjertesvikt.

Under transplantasjonsprosedyren fjernes det syke hjertet, noe som gir en unik mulighet til å samle prøver som er kvalifisert for grundig mitokondriell undersøkelse.

De innsamlede myokardvevsprøvene vil bli evaluert med høyoppløsningsrespirometri, som undersøker den glukosekoblede respirasjonskapasiteten til permeabiliserte myokardfibre. Respirasjonskapasiteten i de syke fibrene vil bli sammenlignet med respirasjonskapasiteten i fibre fra koronarfriske HTx-pasienter transplantert 1 til 2 år før anskaffelse av fibrene.

Forhåpentligvis vil kunnskapen som er oppnådd fra denne undersøkelsen bidra med viktig innsikt i den syke myokardiale energimetabolismen. Slik kunnskap kan bane vei for utvikling av behandlinger rettet mot energisubstratforsyning for generering av adenosin-trifosfat produsert av mitokondriene samt mitokondriell funksjon i det sviktende hjertet.

Hypotese:

Den patologiske myokardfunksjonen sett ved hjertesvikt er relatert til dysfunksjonelle hjertemitokondrier.

Objektiv:

For å undersøke om hjerte mitokondriell funksjon i sluttstadium hjertesvikt av flere etiologier er dårligere enn mitokondriell funksjon i transplanterte hjerter uten tegn til avstøtning eller vaskulopati.

Design og endepunkt:

Myokardial mitokondriefunksjon analysert fra 24 eksplanterte hjerter vil bli sammenlignet med endomyocardiale biopsier fra 20 HTx-pasienter ved planlagte biopsier (1 eller 2 år etter implantasjon).

Endepunkter: 1) Mitokondriell respirasjonskapasitet. 2) Mitokondriell kompleks funksjon, ytre membranintegritet og mitokondrieinnhold.

Metoder:

Høyoppløselig respirometri:

Høyoppløselig respirometri brukes til å måle mitokondriell respirasjonskapasitet i endomyocardiale biopsier. Etter passende forberedelse overføres to biopsier til en oksygraf (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Østerrike) for høyoppløselig respirometri. Mitokondriell respirasjonskapasitet vil bli analysert på en trinnvis måte ved hjelp av titreringer av substrater og inhibitorer for å evaluere glukosekoblet respirasjon i fibrene. Høyoppløselig respirometrianalyse utføres innen 8 timer etter at biopsien er tatt.

Etter analyse vil vevet hurtigfryses i flytende nitrogen og lagres i en forskningsbiobank ved -80 grader celsius inntil undersøkelse av sitratsyntaseaktivitet er utført. Deretter vil alt gjenværende vev bli ødelagt.

Elektronmikroskopi:

En prøve fra hver biopsi som brukes til høyoppløselig respirometri vil bli brukt til elektronmikroskopi (EM) for å evaluere mitokondriell volumtetthet (MitoVD) og integritet. Muskelprøver fikseres i 24 timer i glutaraldehyd og vaskes 4x15 minutter med Na-kakodylatbuffer før de støpes i Epon. Det Epon-støpte vevet vil bli lagret i en forskningsbiobank frem til EM-analyse. Ultratynne deler av Epon-blokkene (60 nm) kuttes i tre dybder og farges med uranylacetat og blycitrat. Avbildning utføres med et EM 208 transmisjonselektronmikroskop og et Megaview III-kamera. Alle fibre er fotografert med 10.000 × forstørrelse i en randomisert rekkefølge. MitoVD er estimert fra mitokondrielt fraksjonsareal og bare distinkte fibre vil bli brukt i den endelige analysen.

Statistikk:

Normalfordelte data vil bli presentert som gjennomsnitt ± standardavvik; ikke-normalfordelte data vil bli presentert som median og interkvartilt område. Kategoriske data presenteres som absolutte verdier eller prosenter. Histogrammer og Q-Q plott vil bli brukt for å kontrollere kontinuerlige verdier for normalitet. Forskjeller mellom grupper vil bli vurdert ved t-test for normalfordelte data og Mann-Whitney U-test for ikke-normalfordelte data. Statistisk signifikans ved en p-verdi på <0,05.

Eksempelstørrelsesberegning:

For tiden er det ingen test-retest-evaluering av mitokondriell respirasjonsanalyse i endomyokardiale biopsier fra eksplanterte menneskehjerter. Imidlertid viste en nylig studie utført ved vår avdeling på myokardbiopsier at en total prøvestørrelse på 40 menneskelige forsøkspersoner i et 1:1 parallell gruppedesign var i stand til å identifisere forskjeller mellom de to gruppene (upubliserte data).

Datainnsamling og behandling:

Kildedata vil bli registrert i pasientens elektroniske pasientjournal eller på spesifikke arbeidsark.

Et sentralisert elektronisk saksrapportskjema (CRF) vil bli konstruert for datafangst. Data vil bli lagret frem til ferdigstillelse av prosjektet, deretter vil de bli overført til det danske dataarkivet.

Perspektiver:

HTx er den gyldne standardbehandlingen for pasienter som lider av hjertesvikt i sluttstadiet, men dens begrensninger kan ikke ignoreres. For det første er prosedyren ledsaget av en betydelig risiko og en betydelig prosentandel av pasientene lider av akutt graftsvikt. Videre har HTx-pasienter høyere risiko for alvorlige infeksjoner og kreft, og opptil 50 % av HTx-pasienter lider av kardial allograft vaskulopati 10 år etter transplantasjon, som alle er sterkt relatert til dødelighet. Det er derfor ønskelig å utsette HTx, dersom helse og livskvalitet kan holdes på et akseptabelt nivå. I denne sammenhengen ser mitokondriell funksjon ut til å være sentral, da tilnærminger for å vurdere mitokondriell funksjon i det sviktende hjertet kan vise seg å bane vei for nye oppfølgingsalgoritmer og til og med behandlingsmål.