A szív mitokondriális funkciója a kifejlett emberi szívekben

Háttér:

A szívelégtelenség kezelése az elmúlt évtizedekben jelentősen javult. A javulás ellenére a betegség végstádiumba torkollhat, így az orvosoknak nem marad más kezelési lehetőség, mint a szívátültetés (HTx). A szívelégtelenség hátterében számos etiológia áll. A kardiomiopátia a HTx vezető oka bármely korcsoportban, a koszorúér-betegség pedig a második leggyakoribb ok a felnőtt betegeknél.

A mitokondriális funkció változásait a szívelégtelenség kulcstényezőiként ismerték fel. A mitokondriumok komplex kölcsönhatásának megértése az anyagcsere és a sejt apoptózis szabályozásában új perspektívákat hozott a szívelégtelenség kutatásában. Ma már ismert, hogy szívelégtelenség során megváltozik a szívizom mitokondriális sűrűsége, működésük és integritásuk károsodik.

A transzplantációs eljárás során a beteg szívet eltávolítják, ami egyedülálló lehetőséget biztosít az alapos mitokondriális vizsgálatra alkalmas minták gyűjtésére.

Az összegyűjtött szívizom szövetmintákat nagyfelbontású respirometriával értékeljük, megvizsgálva a permeabilizált szívizomrostok glükóz kapcsolt légzési kapacitását. A beteg rostok légzési kapacitását összehasonlítják a rostok megszerzése előtt 1-2 évvel átültetett koszorúér egészséges HTx betegek rostjainak légzési kapacitásával.

Remélhetőleg a vizsgálat során szerzett ismeretek fontos betekintést nyújtanak a beteg szívizom energiaanyagcseréjébe. Az ilyen ismeretek kikövezhetik az utat olyan kezelések kifejlesztéséhez, amelyek a mitokondriumok által termelt adenozin-trifoszfát termeléséhez szükséges energiaszubsztrát-ellátást, valamint a szívelégtelenségben lévő mitokondriális funkciót célozzák.

Hipotézis:

A szívelégtelenségben észlelt patológiás szívizom működés a szív mitokondriumainak diszfunkcionális működéséhez kapcsolódik.

Célkitűzés:

Annak vizsgálata, hogy a szív mitokondriális funkciója több etiológiájú szívelégtelenség végstádiumában rosszabb-e, mint az átültetett szívekben, ahol nincsenek kilökődés vagy vasculopathia jelei.

Tervezés és végpont:

A 24 kiültetett szívből elemzett myocardialis mitokondriális funkciót 20 HTx-beteg endomyocardiális biopsziájával hasonlítják össze ütemezett biopsziák alkalmával (1 vagy 2 évvel a beültetés után).

Végpontok: 1) Mitokondriális légzési kapacitás. 2) Mitokondriális komplex funkció, külső membrán integritás és mitokondriális tartalom.

Mód:

Nagy felbontású respirometria:

A nagy felbontású respirometriát endomiokardiális biopsziákban a mitokondriális légzési kapacitás mérésére használják. Megfelelő előkészítés után két biopsziát átviszünk egy oxigráfra (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Ausztria) nagy felbontású respirometria céljából. A mitokondriális légzési kapacitást lépésről lépésre elemzik a szubsztrátok és inhibitorok titrálásával, hogy értékeljék a glükózhoz kapcsolt légzést a rostokban. A nagy felbontású respirometriás analízist a biopszia felvételét követő 8 órán belül végezzük.

Az elemzés után a szövetet folyékony nitrogénben lefagyasztják, és egy kutatási biobankban tárolják -80 Celsius fokon, amíg a citrát-szintáz aktivitás vizsgálatát el nem végzik. Ezt követően minden megmaradt szövet megsemmisül.

Elektronmikroszkóp:

A nagy felbontású respirometriához használt minden biopsziából vett mintát elektronmikroszkópiához (EM) használnak fel a mitokondriális térfogatsűrűség (MitoVD) és integritás értékelésére. Az izommintákat 24 órán át glutáraldehidben fixáljuk, és 4x15 percig mossuk Na-kakodilát pufferrel, mielőtt Eponba öntjük. Az Epon öntött szövetet egy kutatási biobankban tárolják az EM-elemzésig. Az Epon-tömbök ultravékony metszeteit (60 nm) három mélységben vágják, és uranil-acetáttal és ólom-citráttal megfestik. A képalkotás EM 208 transzmissziós elektronmikroszkóppal és Megaview III kamerával történik. Minden szálat 10 000-szeres nagyítással fényképeznek le véletlenszerű sorrendben. A MitoVD-t a mitokondriális frakcionált terület alapján becsülik meg, és csak különálló rostokat használnak a végső elemzésben.

Statisztika:

A normál eloszlású adatok átlag ± szórásként jelennek meg; A nem normál eloszlású adatok medián és interkvartilis tartományként jelennek meg. A kategorikus adatok abszolút értékek vagy százalékok formájában jelennek meg. Hisztogramokat és Q-Q diagramokat használunk a folytonos értékek normalitás ellenőrzésére. A csoportok közötti különbségeket normál eloszlású adatok esetén t-próbával, a nem normál eloszlású adatok esetében Mann-Whitney U teszttel értékeljük. Statisztikai szignifikancia <0,05 p-értéknél.

Mintaméret számítás:

Jelenleg nincs teszt-újrateszt értékelése a mitokondriális légzéselemzésnek a kiültetett emberi szívekből származó endomiokardiális biopsziákban. Egy nemrégiben, az osztályunkon végzett szívizombiopsziával végzett vizsgálat azonban azt mutatta, hogy egy 1:1 arányú párhuzamos csoporttervezésben összesen 40 emberből álló minta alapján sikerült azonosítani a különbségeket a két csoport között (nem publikált adatok).

Adatgyűjtés és feldolgozás:

A forrásadatokat a páciens elektronikus betegnyilvántartásában vagy meghatározott munkalapokon rögzítik.

Az adatrögzítéshez központosított elektronikus esetjelentési űrlapot (CRF) készítenek. Az adatokat a projekt befejezéséig tároljuk, ezt követően továbbítják a dán adatarchívumhoz.

Perspektívák:

A HTx az arany standard kezelés a végstádiumú szívelégtelenségben szenvedő betegek számára, de korlátait nem lehet figyelmen kívül hagyni. Először is, az eljárás jelentős kockázattal jár, és a betegek jelentős százaléka akut graft-elégtelenségben szenved. Ezenkívül a HTx-betegeknél nagyobb a súlyos fertőzések és a rák kockázata, és a HTx-betegek akár 50%-a szív allograft vasculopathiában szenved 10 évvel a transzplantáció után, amelyek mindegyike szorosan összefügg a mortalitással. Ezért a HTx elhalasztása kívánatos, ha az egészséget és az életminőséget elfogadható szinten lehet tartani. Ebben az összefüggésben a mitokondriális funkció kulcsfontosságúnak tűnik, mivel a szívelégtelenségben a mitokondriális funkció értékelésére szolgáló megközelítések új nyomon követési algoritmusok és akár kezelési célok felé nyithatnak utat.