Сердечная митохондриальная функция в эксплантированных человеческих сердцах

Фон:

Лечение сердечной недостаточности значительно улучшилось за последние десятилетия. Несмотря на это улучшение, болезнь может перейти в терминальную стадию, в конечном итоге оставив врачей без другого варианта лечения, кроме трансплантации сердца (HTx). Существует несколько этиологий, лежащих в основе сердечной недостаточности. Кардиомиопатия является ведущей причиной АГ в любой возрастной группе, а ишемическая болезнь сердца является второй по частоте причиной у взрослых пациентов.

Изменения в функции митохондрий были признаны ключевыми факторами сердечной недостаточности. Понимание сложного взаимодействия митохондрий в регуляции метаболизма и клеточного апоптоза открыло новые перспективы в исследованиях сердечной недостаточности. В настоящее время известно, что при сердечной недостаточности изменяется плотность митохондрий миокарда, нарушается их функция и целостность.

Во время процедуры трансплантации больное сердце удаляется, что дает уникальную возможность собрать образцы, подходящие для тщательного митохондриального исследования.

Собранные образцы миокардиальной ткани будут оцениваться с помощью респирометрии высокого разрешения, исследуя связанную с глюкозой дыхательную способность пермеабилизированных миокардиальных волокон. Дыхательная способность в пораженных волокнах будет сравниваться с дыхательной способностью в волокнах от коронарно-здоровых пациентов с HTx, трансплантированных за 1-2 года до приобретения волокон.

Надеемся, что знания, полученные в результате этого исследования, помогут лучше понять энергетический метаболизм больного миокарда. Такие знания могут проложить путь к разработке методов лечения, направленных на поставку энергетического субстрата для выработки аденозинтрифосфата, вырабатываемого митохондриями, а также на функцию митохондрий при сердечной недостаточности.

Гипотеза:

Патологическая функция миокарда, наблюдаемая при сердечной недостаточности, связана с дисфункцией сердечных митохондрий.

Цель:

Изучить, уступает ли митохондриальная функция сердца при терминальной стадии сердечной недостаточности различной этиологии по сравнению с митохондриальной функцией трансплантированного сердца без признаков отторжения или васкулопатии.

Дизайн и конечная точка:

Митохондриальная функция миокарда, проанализированная из 24 эксплантированных сердец, будет сравниваться с эндомиокардиальными биоптатами 20 пациентов с HTx при запланированных биопсиях (через 1 или 2 года после имплантации).

Конечные точки: 1) Митохондриальная дыхательная способность. 2) Функция митохондриального комплекса, целостность внешней мембраны и митохондриальное содержимое.

Методы:

Респирометрия высокого разрешения:

Респирометрия с высоким разрешением используется для измерения митохондриальной дыхательной способности в эндомиокардиальных биоптатах. После соответствующей подготовки две биопсии переносятся на оксиграф (Oxygraph-2k; Oroboros, Инсбрук, Австрия) для респирометрии с высоким разрешением. Митохондриальная дыхательная способность будет анализироваться поэтапно с использованием титрования субстратов и ингибиторов для оценки дыхания, связанного с глюкозой, в волокнах. Анализ респирометрии высокого разрешения проводится в течение 8 часов после взятия биопсии.

После анализа ткань быстро замораживают в жидком азоте и хранят в исследовательском биобанке при температуре -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет проведено исследование активности цитратсинтазы. После этого любая оставшаяся ткань будет уничтожена.

Электронная микроскопия:

Образец каждой биопсии, используемый для респирометрии с высоким разрешением, будет использоваться для электронной микроскопии (ЭМ) для оценки объемной плотности митохондрий (MitoVD) и целостности. Образцы мышц фиксируют в течение 24 часов в глутаральдегиде и промывают 4 раза по 15 минут Na-какодилатным буфером перед заливкой в ​​Epon. Ткань, отлитая из Epon, будет храниться в исследовательском биобанке до проведения ЭМ-анализа. Ультратонкие срезы Эпон-блоков (60 нм) вырезают на три глубины и окрашивают уранилацетатом и цитратом свинца. Визуализация осуществляется с помощью просвечивающего электронного микроскопа EM 208 и камеры Megaview III. Все волокна фотографируются при 10000-кратном увеличении в случайном порядке. MitoVD оценивается по фракционной площади митохондрий, и в окончательном анализе будут использоваться только отдельные волокна.

Статистика:

Нормально распределенные данные будут представлены как среднее ± стандартное отклонение; данные с ненормальным распределением будут представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона. Категориальные данные представлены в виде абсолютных значений или процентов. Гистограммы и графики Q-Q будут использоваться для проверки непрерывных значений на нормальность. Различия между группами будут оцениваться с помощью t-критерия для нормально распределенных данных и U-критерия Манна-Уитни для ненормально распределенных данных. Статистическая значимость при p-значении <0,05.

Расчет размера выборки:

В настоящее время нет ретестовой оценки митохондриального респираторного анализа эндомиокардиальных биопсий из эксплантированных человеческих сердец. Однако недавнее исследование биопсии миокарда, проведенное в нашем отделении, показало, что общий размер выборки из 40 человек в параллельном групповом дизайне 1: 1 позволил выявить различия между двумя группами (неопубликованные данные).

Сбор и обработка данных:

Исходные данные будут записаны в электронную карту пациента или в специальные рабочие листы.

Для сбора данных будет создана централизованная электронная форма истории болезни (CRF). Данные будут храниться до завершения проекта, после чего они будут переданы в Датский архив данных.

Перспективы:

HTx является золотым стандартом лечения пациентов с терминальной стадией сердечной недостаточности, но ее ограничения нельзя игнорировать. Во-первых, процедура сопряжена со значительным риском и у значительного процента пациентов наблюдается острая недостаточность трансплантата. Кроме того, пациенты с АГ имеют более высокий риск развития тяжелых инфекций и рака, и до 50 % пациентов с АГ страдают васкулопатией сердечного аллотрансплантата через 10 лет после трансплантации, что тесно связано со смертностью. Следовательно, желательна отсрочка ТС, если можно сохранить здоровье и качество жизни на приемлемом уровне. В этом контексте митохондриальная функция кажется ключевой, поскольку подходы к оценке митохондриальной функции при сердечной недостаточности могут проложить путь для новых алгоритмов последующего наблюдения и даже целей лечения.