Funzione mitocondriale cardiaca nei cuori umani espiantati

Sfondo:

Il trattamento dell'insufficienza cardiaca è notevolmente migliorato negli ultimi decenni. Nonostante questo miglioramento, la malattia può progredire fino a uno stadio terminale, lasciando i medici senza altra opzione terapeutica che il trapianto di cuore (HTx). Esistono molteplici eziologie alla base dell'insufficienza cardiaca. La cardiomiopatia è la principale causa di HTx in qualsiasi gruppo di età, mentre la malattia coronarica è la seconda causa più comune nei pazienti adulti.

Le alterazioni della funzione mitocondriale sono state riconosciute come fattori chiave nell'insufficienza cardiaca. La comprensione della complessa interazione dei mitocondri nella regolazione del metabolismo e dell'apoptosi cellulare ha aperto nuove prospettive alla ricerca sullo scompenso cardiaco. È ora noto che la densità mitocondriale del miocardio cambia e la loro funzione e integrità sono compromesse durante l'insufficienza cardiaca.

Durante la procedura di trapianto il cuore malato viene rimosso, offrendo un'opportunità unica di raccogliere campioni idonei per un esame mitocondriale approfondito.

I campioni di tessuto miocardico raccolti saranno valutati con Respirometria ad Alta Risoluzione, esaminando la capacità respiratoria accoppiata al glucosio delle fibre miocardiche permeabilizzate. La capacità respiratoria nelle fibre malate sarà confrontata con la capacità respiratoria nelle fibre di pazienti HTx coronarici sani trapiantati da 1 a 2 anni prima dell'acquisizione delle fibre.

Si spera che le conoscenze acquisite da questa indagine contribuiscano con importanti intuizioni nel metabolismo energetico miocardico malato. Tale conoscenza può aprire la strada allo sviluppo di trattamenti mirati all'approvvigionamento di substrati energetici per la generazione di adenosina-trifosfato prodotta dai mitocondri e alla funzione mitocondriale nel cuore debole.

Ipotesi:

La funzione miocardica patologica osservata nell'insufficienza cardiaca è correlata ai mitocondri cardiaci disfunzionali.

Obbiettivo:

Per esaminare se la funzione mitocondriale cardiaca nell'insufficienza cardiaca allo stadio terminale di eziologie multiple è inferiore alla funzione mitocondriale nei cuori trapiantati senza segni di rigetto o vasculopatia.

Progettazione e punto finale:

La funzione mitocondriale miocardica analizzata da 24 cuori espiantati sarà confrontata con le biopsie endomiocardiche di 20 pazienti HTx alle biopsie programmate (1 o 2 anni dopo l'impianto).

Endpoint: 1) Capacità respiratoria mitocondriale. 2) Funzione del complesso mitocondriale, integrità della membrana esterna e contenuto mitocondriale.

Metodi:

Respirometria ad alta risoluzione:

La respirometria ad alta risoluzione viene utilizzata per misurare la capacità respiratoria mitocondriale nelle biopsie endomiocardiche. Dopo un'adeguata preparazione, due biopsie vengono trasferite su un ossigrafo (Oxygraph-2k; Oroboros, Innsbruck, Austria) per la respirometria ad alta risoluzione. La capacità respiratoria mitocondriale sarà analizzata in modo graduale utilizzando titolazioni di substrati e inibitori per valutare la respirazione accoppiata al glucosio nelle fibre. L'analisi respirometrica ad alta risoluzione viene eseguita entro 8 ore dall'esecuzione della biopsia.

Dopo l'analisi il tessuto sarà congelato in azoto liquido e conservato in una biobanca di ricerca a -80 gradi centigradi fino all'esame dell'attività della citrato sintasi. Successivamente, qualsiasi tessuto rimanente verrà distrutto.

Microscopio elettronico:

Un campione di ciascuna biopsia utilizzata per la respirometria ad alta risoluzione verrà utilizzato per la microscopia elettronica (EM) per valutare la densità del volume mitocondriale (MitoVD) e l'integrità. I campioni muscolari vengono fissati per 24 ore in glutaraldeide e lavati 4x15 minuti con tampone Na-cacodilato prima di essere fusi in Epon. Il tessuto fuso Epon sarà conservato in una biobanca di ricerca fino all'analisi EM. Le sezioni ultrasottili dei blocchi Epon (60 nm) sono tagliate a tre profondità e colorate con acetato di uranile e citrato di piombo. L'imaging viene eseguito con un microscopio elettronico a trasmissione EM 208 e una fotocamera Megaview III. Tutte le fibre sono fotografate a 10.000 ingrandimenti in ordine casuale. MitoVD è stimato dall'area frazionaria mitocondriale e nell'analisi finale verranno utilizzate solo fibre distinte.

Statistiche:

I dati normalmente distribuiti saranno presentati come media ± deviazione standard; i dati non distribuiti normalmente saranno presentati come mediana e intervallo interquartile. I dati categorici sono presentati come valori assoluti o percentuali. Verranno utilizzati istogrammi e grafici Q-Q per verificare la normalità dei valori continui. Le differenze tra i gruppi saranno valutate mediante test t per dati distribuiti normalmente e test U di Mann-Whitney per dati non distribuiti normalmente. Significatività statistica a un valore p <0,05.

Calcolo della dimensione del campione:

Al momento non esiste una valutazione test-retest dell'analisi respiratoria mitocondriale nelle biopsie endomiocardiche da cuori umani espiantati. Tuttavia, un recente studio condotto presso il nostro dipartimento sulle biopsie miocardiche ha dimostrato che un campione totale di 40 soggetti umani in un disegno a gruppi paralleli 1:1 è stato in grado di identificare le differenze tra i due gruppi (dati non pubblicati).

Raccolta ed elaborazione dei dati:

I dati di origine saranno registrati nella cartella clinica elettronica del paziente o su specifici fogli di lavoro.

Verrà costruito un Case Report Form (CRF) elettronico centralizzato per l'acquisizione dei dati. I dati saranno conservati fino al completamento del progetto, dopodiché saranno trasmessi agli archivi dati danesi.

Prospettive:

HTx è il trattamento standard per i pazienti affetti da insufficienza cardiaca allo stadio terminale, ma i suoi limiti non possono essere ignorati. In primo luogo, la procedura è accompagnata da un rischio sostanziale e una percentuale significativa di pazienti soffre di fallimento acuto del trapianto. Inoltre, i pazienti HTx hanno un rischio più elevato di infezioni gravi e cancro e fino al 50% dei pazienti HTx soffre di vasculopatia cardiaca da allotrapianto 10 anni dopo il trapianto, tutti fattori altamente correlati alla mortalità. Pertanto, è auspicabile posticipare l'HTx, se la salute e la qualità della vita possono essere mantenute a un livello accettabile. In questo contesto, la funzione mitocondriale sembra essere fondamentale, poiché gli approcci per valutare la funzione mitocondriale nel cuore insufficienza possono rivelarsi per aprire la strada a nuovi algoritmi di follow-up e persino obiettivi di trattamento.