Implikace 5-HT7 receptoru v zánětlivých mechanismech u roztroušené sklerózy (5-HTSEP)

Modulace exprese 5-HT7 receptoru bude zkoumána v korelaci s imunologickým kontextem u různých skupin pacientů s RS:

• Skupina 1: Pacienti s RS s akutním relapsem
• Skupina 2: Stabilní pacienti s RS léčení natalizumabem

• Skupina 3: Zdraví lidé (z Etablissement Français du Sang)

  1. Hodnocení exprese 5-HT7 receptoru na cirkulujících leukocytových buňkách Každá skupina představuje jiný zánětlivý kontext. Výzkumník chce určit vliv imunologického kontextu na expresi 5-HT7 receptoru a které buňky jej exprimují. Pro analýzu exprese 5-HT7 na cirkulujících leukocytových buňkách výzkumník provede studie průtokové cytometrie z plné krve tří výše uvedených skupin. V prvním kroku bude výzkumník analyzovat celkovou míru cirkulujících pozitivních buněk 5-HT7 pomocí protilátky proti receptoru 5-HT7, jejíž specificita byla ověřena v našem výzkumném týmu. Ve druhém kroku výzkumník upřesní, který buněčný typ z lymfocytů implikovaných v patologii RS exprimuje 5-HT7 receptor. Výzkumník použije protilátky proti každé populační t pomocné buňce: Thl, Th2, Th17 a Treg. Zkoušející také provede imunobarvení Cytospinu (tenká vrstva krvinek na krycích sklíčkách), aby vizualizoval společné značení a potvrdil výsledky průtokové cytometrie.
  2. Korelace mezi expresí 5-HT7 receptoru a množstvím mRNA Kromě toho byla prokázána korelace mezi zvýšením počtu 5-HT7 pozitivních buněk a regulací množství mRNA. U těchto tří skupin výzkumník určí množství 5-HT7 mRNA na cirkulujících leukocytových buňkách. V prvním kroku výzkumník zkontroluje korelaci mezi rychlostí exprese 5-HT7 receptoru a množstvím mRNA na cirkulujících leukocytových buňkách pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR). Ve druhém kroku výzkumník provede třídění buněk za účelem izolace buněk Th1, Th2, Th17 a Treg a specificky extrahuje mRNA 5-HT7. Tímto způsobem může výzkumník řešit roli 5-HT7 receptoru na jednom nebo více specifických typech buněk na MS.
  3. Modulace receptoru 5-HT7 podle imunologického kontextu Aby bylo možné porozumět potenciální úloze receptoru 5-HT7 na zmírnění imunitní odpovědi, výzkumník identifikuje imunitní kontext pomocí dávkování ELISA ze vzorků séra. Výzkumník bude zkoumat prozánětlivé markery jako IL1b, IFNg, IL17 a protizánětlivé markery jako IL10 a IL4. Tyto výsledky budou korelovány s předchozími výsledky týkajícími se exprese/kvantity 5-HT7 receptoru pro každou skupinu pacientů.
  4. Role receptoru 5-HT7 na funkcích lymfocytů in vitro Ze vzorků krve tří výše uvedených skupin výzkumník izoluje mononukleární buňky periferní krve (PBMC) in vitro, aby vyhodnotil roli receptoru 5-HT7 na jejich funkci produkovat a uvolňovat cytokiny. . Výzkumník bude stimulovat PBMC jedním nebo více ligandy 5-HT7 a provede dávkování ELISA ze supernatantu s prozánětlivými markery jako IL1b, IFNg, IL17 a protizánětlivými markery jako IL10 a IL4. Buněčné imunoznačení bude provedeno za účelem vizualizace 5-HT7 receptoru na buněčném povrchu.
  5. Identifikace izoforem receptoru 5-HT7 Existují tři formy receptoru 5-HT7 (5-HT7a, 5-HT7b, 5-HT7d). Pro jejich farmakologickou funkci však dosud nebyl popsán žádný rozdíl. Výzkumník navrhuje identifikovat tyto různé izoformy pomocí qPCR. Jak bylo popsáno dříve, v prvním kroku na cirkulujících leukocytových buňkách a ve druhém kroku po třídění buněk k izolaci buněk Thl, Th2, Th17 a Treg.