Implicazione del recettore 5-HT7 nei meccanismi infiammatori nella sclerosi multipla (5-HTSEP)

La modulazione dell'espressione del recettore 5-HT7 sarà studiata in correlazione con il contesto immunologico, in diversi gruppi di pazienti affetti da SM:

• Gruppo 1: pazienti affetti da SM con recidiva acuta
• Gruppo 2: pazienti con SM stabile trattati con Natalizumab

• Gruppo 3: Persone sane (da Etablissement Français du Sang)

  1. Valutazione dell'espressione del recettore 5-HT7 sulle cellule leucocitarie circolanti Ciascun gruppo presenta un diverso contesto infiammatorio. Il ricercatore desidera determinare l'influenza del contesto immunologico sull'espressione del recettore 5-HT7 e quali cellule lo esprimono. Per analizzare l'espressione di 5-HT7 sulle cellule leucocitarie circolanti, il ricercatore eseguirà studi di citometria a flusso dal sangue intero dei tre gruppi sopra menzionati. In una prima fase, lo sperimentatore analizzerà il tasso complessivo di cellule positive circolanti 5-HT7 mediante l'uso di un anticorpo contro il recettore 5-HT7 la cui specificità è stata convalidata nel nostro gruppo di ricerca. In una seconda fase, lo sperimentatore preciserà quale tipo cellulare, tra i linfociti implicati nella patologia della SM, esprime il recettore 5-HT7. Lo sperimentatore utilizzerà anticorpi contro ciascuna cellula t helper della popolazione: Th1, Th2, Th17 e Treg. Lo sperimentatore eseguirà anche l'immunocolorazione su Cytospin (sottile strato di cellule del sangue sui coprioggetti) per visualizzare la co-etichettatura e confermare i risultati della citometria a flusso.
  2. Correlazione tra espressione del recettore 5-HT7 e quantità di mRNA Inoltre, è stata dimostrata una correlazione tra un aumento di cellule 5-HT7 positive e una quantità di mRNA upregolata. Per i tre gruppi, lo sperimentatore determinerà la quantità di mRNA 5-HT7 sulle cellule leucocitarie circolanti. In una prima fase, lo sperimentatore verificherà la correlazione tra il tasso di espressione del recettore 5-HT7 e la quantità di mRNA sulle cellule leucocitarie circolanti, utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). In una seconda fase, l'investigatore eseguirà lo smistamento delle cellule per isolare le cellule Th1, Th2, Th17 e Treg ed estrarre specificamente l'mRNA 5-HT7. In questo modo, l'investigatore può affrontare il ruolo del recettore 5-HT7 su uno o più tipi cellulari specifici sulla SM.
  3. Modulazione del recettore 5-HT7 in base al contesto immunologico Al fine di comprendere il potenziale ruolo del recettore 5-HT7 sulla moderazione della risposta immunitaria, lo sperimentatore identificherà il contesto immunitario mediante dosaggio ELISA da campioni di siero. Lo sperimentatore indagherà su marcatori pro-infiammatori come IL1b, IFNg, IL17 e marcatori anti-infiammatori come IL10 e IL4. Questi risultati saranno correlati con i precedenti risultati riguardanti l'espressione/quantità del recettore 5-HT7 per ciascun gruppo di pazienti.
  4. Ruolo del recettore 5-HT7 sulle funzioni dei linfociti in vitro Dai campioni di sangue dei tre gruppi sopra menzionati, lo sperimentatore isolerà le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in vitro, per valutare il ruolo del recettore 5-HT7 sulla loro funzione di produrre e rilasciare citochine . Lo sperimentatore stimolerà PBMC con uno o più ligandi 5-HT7 ed eseguirà il dosaggio ELISA dal supernatante con marcatori pro-infiammatori come IL1b, IFNg, IL17 e marcatori anti-infiammatori come IL10 e IL4. L'immunomarcatura cellulare sarà eseguita per visualizzare il recettore 5-HT7 sulla superficie cellulare.
  5. Identificazione delle isoforme del recettore 5-HT7 Esistono tre forme di recettore 5-HT7 (5-HT7a, 5-HT7b, 5-HT7d). Tuttavia, nessuna differenza è stata ancora descritta per la loro funzione farmacologica. L'investigatore propone di identificare queste diverse isoforme mediante qPCR. Come precedentemente descritto, in una prima fase, su cellule leucocitarie circolanti e in una seconda fase, dopo cernita cellulare per isolare le cellule Th1, Th2, Th17 e Treg.