Implication des récepteurs 5-HT7 dans les mécanismes inflammatoires de la sclérose en plaques (5-HTSEP)

La modulation de l'expression du récepteur 5-HT7 sera étudiée en corrélation avec le contexte immunologique, dans différents groupes de patients SEP :

• Groupe 1 : patients atteints de SEP avec une rechute aiguë
• Groupe 2 : patients atteints de SEP stables traités par Natalizumab

• Groupe 3 : Personnes saines (de l'Etablissement Français du Sang)

  1. Évaluation de l'expression des récepteurs 5-HT7 sur les cellules leucocytaires circulantes Chaque groupe présente un contexte inflammatoire différent. L'investigateur souhaite déterminer l'influence du contexte immunologique sur l'expression du récepteur 5-HT7 et quelles cellules l'expriment. Pour analyser l'expression de 5-HT7 sur les cellules leucocytaires circulantes, l'investigateur réalisera des études de cytométrie en flux à partir du sang total des trois groupes mentionnés ci-dessus. Dans un premier temps, l'investigateur analysera le taux global de cellules positives circulantes 5-HT7 par l'utilisation d'un anticorps dirigé contre le récepteur 5-HT7 dont la spécificité a été validée dans notre équipe de recherche. Dans un second temps, l'investigateur précisera quel type cellulaire, parmi les lymphocytes impliqués dans la pathologie de la SEP, exprime le récepteur 5-HT7. L'investigateur utilisera des anticorps contre chaque population de cellules auxiliaires : Th1, Th2, Th17 et Treg. L'investigateur effectuera également une immunocoloration sur Cytospin (fine couche de cellules sanguines sur des lamelles) pour visualiser le co-marquage et confirmer les résultats de la cytométrie en flux.
  2. Corrélation entre l'expression du récepteur 5-HT7 et la quantité d'ARNm De plus, une corrélation a été montrée entre une augmentation des cellules 5-HT7 positives et une quantité d'ARNm régulée à la hausse. Pour les trois groupes, l'investigateur déterminera la quantité d'ARNm 5-HT7 sur les cellules leucocytaires circulantes. Dans un premier temps, l'investigateur vérifiera la corrélation entre le taux d'expression du récepteur 5-HT7 et la quantité d'ARNm sur les cellules leucocytaires circulantes, en utilisant la Polymerase Chain Reaction (qPCR) quantitative. Dans un deuxième temps, l'investigateur effectuera un tri cellulaire pour isoler les cellules Th1, Th2, Th17 et Treg et extraire spécifiquement l'ARNm 5-HT7. De cette manière, l'investigateur peut aborder le rôle du récepteur 5-HT7 sur un ou plusieurs types de cellules spécifiques sur la SEP.
  3. Modulation du récepteur 5-HT7 en fonction du contexte immunologique Afin de comprendre le rôle potentiel du récepteur 5-HT7 sur la modération de la réponse immunitaire, l'investigateur identifiera le contexte immunitaire par dosage ELISA à partir d'échantillons sériques. L'investigateur étudiera des marqueurs pro-inflammatoires comme IL1b, IFNg, IL17 et des marqueurs anti-inflammatoires comme IL10 et IL4. Ces résultats seront corrélés avec les résultats précédents concernant l'expression/quantité des récepteurs 5-HT7 pour chaque groupe de patients.
  4. Rôle des récepteurs 5-HT7 sur les fonctions lymphocytaires in vitro A partir d'échantillons sanguins des trois groupes mentionnés ci-dessus, l'investigateur isolera in vitro des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), afin d'évaluer le rôle des récepteurs 5-HT7 sur leur fonction de production et de libération de cytokines . L'investigateur stimulera les PBMC avec un ou plusieurs ligands 5-HT7 et effectuera un dosage ELISA à partir du surnageant avec des marqueurs pro-inflammatoires comme IL1b, IFNg, IL17 et des marqueurs anti-inflammatoires comme IL10 et IL4. L'immunomarquage cellulaire sera effectué pour visualiser le récepteur 5-HT7 à la surface des cellules.
  5. Identification des isoformes du récepteur 5-HT7 Il existe trois formes de récepteur 5-HT7 (5-HT7a, 5-HT7b, 5-HT7d). Cependant, aucune différence n'a encore été décrite pour leur fonction pharmacologique. L'investigateur propose d'identifier ces différentes isoformes par qPCR. Comme décrit précédemment, dans un premier temps, sur des cellules leucocytaires circulantes et dans un second temps, après tri cellulaire pour isoler les cellules Th1, Th2, Th17 et Treg.