Implicación del receptor 5-HT7 en los mecanismos inflamatorios de la esclerosis múltiple (5-HTSEP)

Se investigará la modulación de la expresión del receptor 5-HT7 en correlación con el contexto inmunológico, en diferentes grupos de pacientes con EM:

• Grupo 1: pacientes con EM con una recaída aguda
• Grupo 2: Pacientes con EM estable tratados con Natalizumab

• Grupo 3: Gente sana (del Etablissement Français du Sang)

  1. Evaluación de la expresión del receptor 5-HT7 en células leucocitarias circulantes Cada grupo presenta un contexto inflamatorio diferente. El investigador desea determinar la influencia del contexto inmunológico en la expresión del receptor 5-HT7 y qué células lo expresan. Para analizar la expresión de 5-HT7 en las células leucocitarias circulantes, el investigador realizará estudios de citometría de flujo de la sangre total de los tres grupos mencionados anteriormente. En un primer paso, el investigador analizará la tasa global de células positivas circulantes 5-HT7 mediante el uso de un anticuerpo contra el receptor 5-HT7 cuya especificidad fue validada en nuestro equipo de investigación. En un segundo paso, el investigador precisará qué tipo de células, entre los linfocitos implicados en la patología de la EM, expresan el receptor 5-HT7. El investigador utilizará anticuerpos contra cada célula auxiliar de la población: Th1, Th2, Th17 y Treg. El investigador también realizará inmunotinción en Cytospin (capa delgada de células sanguíneas en cubreobjetos) para visualizar el marcaje conjunto y confirmar los resultados de la citometría de flujo.
  2. Correlación entre la expresión del receptor 5-HT7 y la cantidad de ARNm Además, se ha demostrado una correlación entre un aumento de células positivas para 5-HT7 y una cantidad regulada de ARNm. Para los tres grupos, el investigador determinará la cantidad de ARNm de 5-HT7 en las células leucocitarias circulantes. En un primer paso, el investigador verificará la correlación entre la tasa de expresión del receptor 5-HT7 y la cantidad de ARNm en las células leucocitarias circulantes mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). En un segundo paso, el investigador realizará la clasificación celular para aislar las células Th1, Th2, Th17 y Treg y extraer específicamente el ARNm de 5-HT7. De esta forma, el investigador puede abordar el papel del receptor 5-HT7 en uno o más tipos de células específicas en la EM.
  3. Modulación del receptor 5-HT7 según el contexto inmunológico Para comprender el papel potencial del receptor 5-HT7 en la moderación de la respuesta inmunitaria, el investigador identificará el contexto inmunitario mediante la dosificación ELISA a partir de muestras de suero. El investigador investigará sobre marcadores proinflamatorios como IL1b, IFNg, IL17 y marcadores antiinflamatorios como IL10 e IL4. Estos resultados se correlacionarán con los resultados anteriores relativos a la expresión/cantidad del receptor 5-HT7 para cada grupo de pacientes.
  4. Papel del receptor 5-HT7 en las funciones de los linfocitos in vitro A partir de muestras de sangre de los tres grupos mencionados anteriormente, el investigador aislará las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) in vitro, para evaluar el papel del receptor 5-HT7 en su función de producir y liberar citocinas. . El investigador estimulará las PBMC con uno o más ligandos 5-HT7 y realizará una dosificación ELISA a partir del sobrenadante con marcadores proinflamatorios como IL1b, IFNg, IL17 y marcadores antiinflamatorios como IL10 e IL4. Se realizará el inmunomarcaje celular para visualizar el receptor 5-HT7 en la superficie celular.
  5. Identificación de las isoformas del receptor 5-HT7 Hay tres formas de receptor 5-HT7 (5-HT7a, 5-HT7b, 5-HT7d). Sin embargo, aún no se ha descrito ninguna diferencia en cuanto a su función farmacológica. El investigador propone identificar estas diferentes isoformas mediante qPCR. Como se describió anteriormente, en un primer paso, en las células leucocitarias circulantes y en un segundo paso, después de la clasificación celular para aislar las células Th1, Th2, Th17 y Treg.