Implicação do Receptor 5-HT7 nos Mecanismos Inflamatórios da Esclerose Múltipla (5-HTSEP)

A modulação da expressão do receptor 5-HT7 será investigada em correlação com o contexto imunológico, em diferentes grupos de pacientes com EM:

• Grupo 1: pacientes com EM com recaída aguda
• Grupo 2: Pacientes com EM estáveis ​​tratados com Natalizumabe

• Grupo 3: Pessoas saudáveis ​​(do Etablissement Français du Sang)

  1. Avaliação da expressão do receptor 5-HT7 em células leucocitárias circulantes Cada grupo apresenta um contexto inflamatório diferente. O investigador deseja determinar a influência do contexto imunológico na expressão do receptor 5-HT7 e quais células o expressam. Para analisar a expressão de 5-HT7 nas células leucocitárias circulantes, o pesquisador realizará estudos de citometria de fluxo no sangue total dos três grupos mencionados acima. Numa primeira fase, o investigador irá analisar a taxa global de células 5-HT7 circulantes positivas através da utilização de um anticorpo contra o receptor 5-HT7 cuja especificidade foi validada na nossa equipa de investigação. Em uma segunda etapa, o investigador vai precisar qual tipo de célula, dentre os linfócitos implicados na patologia da EM, expressa o receptor 5-HT7. O investigador usará anticorpos contra cada célula t helper da população: Th1, Th2, Th17 e Treg. O investigador também realizará imunocoloração em Cytospin (camada fina de células sanguíneas em lamínulas) para visualizar a co-rotulagem e confirmar os resultados da citometria de fluxo.
  2. Correlação entre a expressão do receptor 5-HT7 e a quantidade de mRNA Além disso, foi demonstrada uma correlação entre um aumento de células 5-HT7 positivas e uma quantidade de mRNA regulada. Para os três grupos, o investigador determinará a quantidade de mRNA de 5-HT7 nas células leucocitárias circulantes. Em uma primeira etapa, o investigador verificará a correlação entre a taxa de expressão do receptor 5-HT7 e a quantidade de mRNA nas células leucocitárias circulantes, utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase (qPCR) quantitativa. Em uma segunda etapa, o investigador realizará a separação de células para isolar células Th1, Th2, Th17 e Treg e extrair especificamente o mRNA de 5-HT7. Desta forma, o investigador pode abordar o papel do receptor 5-HT7 em um ou mais tipos de células específicas no MS.
  3. Modulação do receptor 5-HT7 de acordo com o contexto imunológico Para entender o papel potencial do receptor 5-HT7 na moderação da resposta imune, o investigador identificará o contexto imunológico por dosagem de ELISA a partir de amostras de soro. O investigador irá investigar marcadores pró-inflamatórios como IL1b, IFNg, IL17 e marcadores anti-inflamatórios como IL10 e IL4. Esses resultados serão correlacionados com os resultados anteriores referentes à expressão/quantidade do receptor 5-HT7 para cada grupo de pacientes.
  4. Papel do receptor 5-HT7 nas funções dos linfócitos in vitro A partir de amostras de sangue dos três grupos mencionados acima, o investigador isolará células mononucleares do sangue periférico (PBMC) in vitro, para avaliar o papel do receptor 5-HT7 em sua função de produzir e liberar citocinas . O investigador estimulará PBMC com um ou mais ligantes 5-HT7 e realizará dosagem de ELISA a partir do sobrenadante com marcadores pró-inflamatórios como IL1b, IFNg, IL17 e marcadores anti-inflamatórios como IL10 e IL4. A imunomarcação celular será realizada para visualizar o receptor 5-HT7 na superfície celular.
  5. Identificação das isoformas do receptor 5-HT7 Existem três formas de receptor 5-HT7 (5-HT7a, 5-HT7b, 5-HT7d). No entanto, ainda não foi descrita nenhuma diferença quanto à sua função farmacológica. O investigador propõe identificar essas diferentes isoformas por qPCR. Conforme descrito anteriormente, em uma primeira etapa, em células leucocitárias circulantes e em uma segunda etapa, após separação de células para isolar células Th1, Th2, Th17 e Treg.