Ikke-invasiv kromosomal screening for embryoselektionsforsøg (NICEST)

Hypotese:

Analyse af cellefrit DNA (cfDNA) frigivet fra udviklende embryoner til brugte kulturmedier (SCM) kan tjene som en ikke-invasiv metode til at udføre præimplantations genetisk testning for aneuploidi (PGT-A). En ikke-selektionsundersøgelse, der sammenligner kliniske resultater med NI-PGT-A-resultaterne af de overførte embryoner på en blindet måde, vil karakterisere den diagnostiske nøjagtighed ved at bestemme positive og negative prædiktive værdier

Begrundelse:

Under in vitro fertiliseringsprocessen (IVF) er valget af et sundt embryo begrænset af det mikroskopiske udseendes manglende evne til at afsløre det kromosomale komplement. For pålideligt at udvælge kromosomalt normale embryoner udføres præimplantations genetisk testning for aneuploidi (PGT-A). PGT-A kræver biopsi af embryoet, amplifikation af DNA'et og derefter næste generations sekventering (NGS) for at bestemme antallet af kromosomkopi.

Mens den kliniske anvendelighed af PGT-A er blevet påvist, har processen begrænsninger, hvoraf den vigtigste er kravet om embryobiopsi. Typisk fjernes 5-10 celler fra TE, efter at zona pellucida er blevet brudt. Selvom proceduren kan udføres sikkert og effektivt af uddannede embryologer, er den åbenlyse bekymring for beskadigelse af embryoet relevant. Selv hvis implantationen lykkes, er der rejst bekymring for, at biopsi af embryonet på dette stadium kan føre til komplikationer såsom abort eller problemer med placentafunktion senere i graviditeten. Fordi TE er bestemt til at differentiere til placenta i stedet for selve fosteret, er der uenighed om, hvorvidt den kromosomale analyse af disse celler altid er repræsentativ for fosterets kromosomale komplement. Af disse grunde, og fordi TE-biopsi er besværligt og dyrt, har PGT-A stadig ikke fortrængt morfologisk evaluering som den kliniske standard for embryoselektion.

En nøjagtig ikke-invasiv metode til aneuploidiscreening af embryoner før implantation ville være ideel. Til dette formål er udvikling af ikke-invasive PGT-A (NI-PGT-A) metoder et område med aktiv undersøgelse. Tilgangen udnytter evnen til at isolere cellefrit DNA (cfDNA), der udskilles fra blastocysten til det brugte kulturmedie (SCM). SCM kasseres rutinemæssigt, efter at embryonet er blevet fjernet fra kulturen, dog kan små mængder DNA fra embryoet isoleres, amplificeres og derefter sekventeres til kromosomalt kopiantalanalyse. Den åbenlyse fordel er, at denne proces kan forekomme uden at skade embryonet. En yderligere formodet fordel ved denne ikke-invasive tilgang er, at DNA'et udskilles fra både TE og den indre cellemasse (ICM), hvilket teoretisk tjener som en mere nøjagtig repræsentation af den føtale karyotype end DNA'et isoleret fra kun TE-biopsien alene.

Tekniske begrænsninger ved implementering af NI-PGT-A er relateret til den begrænsede mængde DNA, der er tilgængelig i SCM. I modsætning til andre former for genetisk testning, hvor rigelige mængder genetisk materiale let ekstraheres fra blod, fostervand eller vævsbiopsi, er cellefri DNA-sekretion fra blastocyster usædvanligt lille i mængde. Laboratorieprotokoller udvikler sig imidlertid hurtigt, hvilket fremgår af adskillige publikationer, som allerede har vist et højt niveau af konsistens, når kromosomalt kopiantal analyseres med NI-PGT-A og traditionel PGT-A parallelt.

Mens disse undersøgelser har illustreret proof of concept og præklinisk validering, kan den sande diagnostiske nøjagtighed kun vurderes ved at evaluere den prædiktive værdi af negative (euploide) og positive (aneuploide) resultater. Specifikt bør embryoner, der viser sig at være euploide, have en større evne til vedvarende implantation, der fortsætter til levende fødsel, mens aneuploide embryoner bør have en dramatisk lavere hastighed for vedvarende implantation eller vil være forudsigelige for klinisk aneuploidi. Uden streng klinisk validering kan brug af disse resultater til embryoselektion føre til fejldiagnosticering, forårsage udvælgelse af usunde embryoner eller udvælgelse mod embryoner, der kunne have været potentielt levedygtige.

For at afgøre, om NI-PGT-A er klinisk robust, foreslår vi en ikke-selektion, pilotundersøgelse, hvor embryoselektion udføres ved rutinemæssige kliniske metoder (dvs. morfologisk selektion). Efter at det kliniske resultat har manifesteret sig, vil SCM imidlertid blive analyseret af en kommercielt tilgængelig NI-PGT-A-protokoller på en blind måde. Ved at korrelere kliniske resultater med NI-PGT-A resultater kan positive og negative prædiktive værdier beregnes uden bias. Da der ikke vil blive udført intervention, der afviger fra den kliniske rutine, vil der ikke være nogen yderligere risiko for embryoet eller forælderen.

Denne undersøgelse vil tjene som pilot for et muligt fremtidigt forsøg. Hvis en rimelig forudsigelig værdi af NI-PGT-A påvises, kan en prospektiv selektionsundersøgelse være berettiget til at undersøge anvendeligheden af ​​NI-PGT-A i et klinisk miljø.

Forskningsdesign:

Patienter vil gennemgå IVF-ICSI pr. klinisk indikation, med planer om at nedfryse alle embryoner til udskudt embryooverførsel. Embryokultur vil følge rutineprotokoller, og embryoselektion til overførsel vil blive udført ved hjælp af standard morfologiske kriterier. SCM fra alle blastocyster, der synes levedygtige, vil blive indsamlet og sendt til et referencelaboratorium (sekvens 46). Prøver vil blive fuldstændig afidentificeret for patientoplysninger og mærket med et adgangsnummer. NI-PGT-A-analyse vil blive udført ved hjælp af et kommercielt sæt i henhold til producentens anbefalinger, med teknikere blindet for kliniske resultater. Når patienter vender tilbage til embryooverførselscyklussen, vil rutinemæssig klinisk protokol blive fulgt for endometrieforberedelse. Et enkelt embryo vil blive udvalgt i henhold til rutinemæssige morfologiske graderingskriterier, og embryooverførsel vil blive udført med standardteknikker. Det første graviditetsresultat vil blive dokumenteret med serum-hCG-test. Hvis hCG-testen er positiv, vil tidlig graviditet blive bekræftet med ultralydsvurdering pr. klinisk rutine. Efter at alle patienter har afsluttet behandlingen og kliniske resultater manifesteret (mislykket implantation, abort eller igangværende graviditet (defineret som levedygtighed ud over 13 uger), vil NI-PGT-A resultater blive frigivet til det kliniske team og korreleret til kliniske resultater for beregning af prædiktiv værdier. Alle igangværende graviditeter vil blive tilbudt rutineprænatal screening for føtale aneuploidier.

Yderligere detaljer vedrørende laboratorieprotokoller er som følger:

Blastocystkultur Embryokultur vil følge rutineprotokoller. På dag 3 efter befrugtning vil embryoner gentagne gange blive pipetteret gennem en række dyrkningsmediedråber for at sænke potentialet for maternel cellekontamination. Embryoer vil derefter blive dyrket individuelt i 35 µL dråber af embryokulturmedium til blastocyststadiet. På dag 5 eller dag 6 vil blastocystudvikling og kvalitet blive evalueret ved hjælp af standard morfologiske kriterier.

Prøveindsamling og blastocystvitrifikation Blastocystkulturmedium (20µL) fra udvalgte embryoner vil blive opsamlet og overført til PCR-rør og opbevaret ved -20°C indtil helgenomamplifikation (WGA). Blastocyster vil blive frosset via rutinemæssig forglasningsprotokol og opbevaret i flydende nitrogen i henhold til rutinemæssig klinisk protokol. Prøver vil blive fuldstændig afidentificeret for patientoplysninger og mærket med et adgangsnummer inden forsendelse til referencelaboratoriet (Sequence46).

Helgenom-amplifikation og DNA-sekventering NI-PGT-A-analyse vil blive udført ved modtagelse, ved hjælp af et kommercielt sæt i henhold til producentens anbefalinger, med teknikere blindet for kliniske resultater. DNA vil blive amplificeret ved helgenom-amplifikation (WGA) og stregkodet for at forberede biblioteker. Bibliotekerne indlæses derefter på et Ion Chef-instrument til skabelonforberedelse ved automatiseret klonal amplifikation og indlæses derefter på en chip til DNA-sekventering på et Ion Genestudio S5 Prime-system med ca. 150.000-200.000 sekventeringslæsninger pr. prøve. Data analyseres ved hjælp af Ion Reporter-softwaren (v5.10 eller nyere). Ploiditet vil blive målt ved hjælp af baseline, Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline. Standard kvalitetskontrolforanstaltninger vil blive evalueret. Resultaterne vil blive frigivet til det kliniske team 6 uger efter embryooverførsel og korreleret til kliniske resultater for beregning af prædiktive værdier.

Patientpopulation:

Inklusionskriterier:

Patient, der gennemgår IVF-ICSI 21 - 35 år gammel på indskrivningstidspunktet Elektiv frys hele cyklus Planlægning af enkelt embryooverførsel

Ekskluderingskriterier:

Gennemgår PGT-A, PGT-SR, PGT-M Anamnese med tilbagevendende graviditetstab Anamnese med tilbagevendende implantationsfejl Planlægning af overførsel af mere end 1 embryo

Begrundelsen for alderskategorien er at kontrollere for andre aldersrelaterede faktorer end aneuploidi, der kan påvirke implantationen, så variabler, der kan sammensætte prædiktive værdiberegninger, minimeres. Begrænsning af deltagelse til patienter under 35 optimerer også embryoselektion, således at morfologisk normale embryoner højst sandsynligt er sunde. Endvidere har patienter i denne alderskategori den laveste risiko for kliniske aneuploidier såsom Downs syndrom.

Datahåndtering og opbevaring:

Forskningsprøver vil blive identificeret med et unikt adgangsnummer, men ingen patientidentificerende information. Prøverne vil blive behandlet af Sequence46 med resultater forbundet med adgangsnummeret. Dataene vil blive uploadet via en sikker cloud-tjeneste, som vil blive tilgået af den primære efterforsker for at fusionere med den elektroniske sagsrapportformular (eCRF), der vil blive opbevaret lokalt på Olive Fertility Center på en krypteret harddisk, der vil blive sikkerhedskopieret- op på et sekundært lokalt drev. eCRF vil indeholde patienternes unikke journalnummer og alder, men vil ikke dokumentere navn, fødselsdato eller andre identificerende oplysninger. Resultaterne af NI-PGT-A-analysen og det kliniske resultat vil også blive gemt i eCRF.

Forskningsdata vil blive opbevaret i 5 år efter offentliggørelsesdatoen.

Statistisk analyse:

Diagnostisk nøjagtighed vil blive fortolket i sammenhæng med positive og negative prædiktive værdier.

Et positivt resultat er et fund i overensstemmelse med aneuploidi eller mosaicisme. Et negativt resultat er et fund i overensstemmelse med euploidi.

PPV = (Mislykket implantation + abort + klinisk aneuploidi)/ Alle positive resultater NPV = Igangværende graviditet / Alle negative resultater

Beregning af prøvestørrelse:

Et hundrede og tyve (120) patienter skulle være tilstrækkeligt til denne pilotundersøgelse. Tidligere forskning har fastslået, at hos patienter på 35 år eller yngre er forholdet mellem euploide:aneuploide embryoner cirka 60:40. Af euploide embryoner vil cirka 70 % implanteres, hvoraf 85 % skal fortsætte med at være levedygtig. Af aneuploide embryoner vil ca. 25% implantere, hvoraf >99% vil abortere; risikoen for en klinisk aneuploidi er mindre end 0,5 % hos kvinder på 35 år og derunder.

I betragtning af disse sandsynligheder forventes 72 euploide embryoner af de 120 patienter, der skal indskrives, hvoraf 50 skal implanteres og 43 vil fortsætte som igangværende, levedygtige graviditeter. Af de 48, der forventes at være aneuploide, vil 12 implantere, hvoraf alle skulle abortere (chancen for en klinisk aneuploidi i denne population er mindre end 0,5%).

Rekruttering:

Patienter, der forfølger IVF-ICSI på Olive Fertility Center og opfylder inklusions-/eksklusionskriterier, vil blive rekrutteret direkte af co-investigatorerne. Flyers vil blive opslået i klinikken.