Deficient T Regulatory Cell (Treg) funktion hos patienter med recidiverende remitterende multipel sklerose

Undersøgelsen vil inkludere 40 RRMS-patienter (alder 18-55, udvidet handicapstatusskala (EDSS) 0-6) og 40 alders-, køn- og racematchede sunde kontroller (HC'er). Undersøgelsesemnerne vil blive indskrevet på Thomas Jefferson University MS-klinikken, som fungerer som et tertiært henvisningscenter.

Inklusionskriterierne er bekræftet diagnose af RRMS i henhold til McDonald's diagnostiske kriterier12, alder 18-55 inklusive, udvidet handicapstatusscore (EDSS) 1,5-5,5 og ingen immunmodulerende terapi på tidspunktet for undersøgelsen. Behandlingsfri periode vil være mindst 4 uger for IV Methylprednisolon, Interferon-beta, Glatirameracetat, Fingolimod, Tecfidera og Natalizumab. Patienter, der tidligere er behandlet med immunsuppressive terapier, herunder Azathioprin, Methotrexat, Mitoxantron og Cyclophosphamid, vil ikke blive inkluderet i undersøgelsen. Eksklusionskriterier vil omfatte samtidig infektion, betydelig medicinsk og psykiatrisk tilstand efter hovedforskerens skøn. Gravide kvinder og patienter, der deltager i andre forskningsforsøg, vil ikke blive optaget i denne undersøgelse. 40 raske kontroller matchet for alder, køn og race med gruppen af ​​RR MS-patienter vil blive indskrevet i undersøgelsen som en kontrolgruppe.

Mål 1. A. Identificere fænotypeændringerne i CD4+CD25+CD127-nTregs hos RRMS-patienter.

Transkriptionel profilering af sorterede CD4+CD25+CD127-Tregs vil blive udført ved hjælp af RNAseq i den første kohorte på 10 HC'er og 10 RRMS-patienter. CD4+CD25+CD127- Treg-celler vil blive sorteret fra magnetiske perler adskilte CD4+-celler. cDNA vil blive genereret ved hjælp af SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit til sekventering. Påvisningen af ​​differentielt udtrykte gener mellem RRMS-patienter og HC-afledte Treg-celler vil tillade den funktionelle karakterisering af Treg-celler i RRMS. RNA-seq-eksperimenterne og dataanalysen vil blive udført af Dr. Paolo Fortina og Dr. Adam Ertel ved TJU Sidney Kimmel Cancer Center. Den differentielle genekspression i RRMS Tregs identificeret af RNAseq vil blive bekræftet via RT-PCR og western blotting.

Flowcytometriundersøgelser ved hjælp af prøver fra perifere blodmononukleære celler (PBMC) fra den anden kohorte af HC'er og RRMS-patienter (10 donorer i hver gruppe) vil blive brugt til at bestemme ændringer i ekspressionen af ​​Treg-proteinmarkørerne hos RRMS-patienter. Individuelle Treg-markører giver specifikke undertrykkelsesmekanismer. For den omfattende Treg-fænotypiske profilering vil efterforskerne bestemme procentdelen af ​​CTLA-4, CD39, GZB, perforin, GITR, OX40, HLADR, TNFR2, Tim-3, programmeret dødsreceptor (PD-1) og LAG3-positive celler i CD4+CD25+CD127--gatede tregs. FOXP3-, GZB- og perforinekspression vil blive bestemt ved hjælp af intracellulær farvning, samt Tregs' TGF-B, IL-10 og IL-35 cytokinsekretion, som kan bidrage til deres undertrykkende funktion (2x106 PBMC'er pr. 14 farvefarvning).

Mål 1.B. Karakteriser det funktionelle underskud af nTregs i RRMS. Funktionelle suppressionsassays vil sammenligne Treg-undertrykkende funktion i en tredje kohorte på 10 HC- og 10 RRMS-patienter.

Hypotesen er, at Treg-samkulturer med Teff-celler fra HC'er vil øge koncentrationen af ​​TGF-B, IL-10 og IL-35 og reducere koncentrationerne af IFN-y og IL-17A i kultursupernatanter (SN'er) i forhold til suppressionsanalyserne ved hjælp af Treg- og Teff-celler fra RRMS-patienter. For at undersøge følsomheden af ​​Teff-celler i RRMS-patienter sammenlignet med HC'er, vil suppressionsassayene blive udført i et cross-over-designeksperiment:

1. RMS Tregs+RRMS Teff-celler
2. HC Tregs+HC Teff celler
3. RRMS Tregs+HC Teff-celler
4. HC Tregs+RRMS Teff-celler

Sorterede 2x104 CD4+CD25+CD127- Tregs pr. tilstand vil blive dyrket sammen med autologe Teff CFSE-farvede CD4+CD25-CD127+ celler i nærværelse af aCD3 (0,5 ug/ml) og aCD28 (1 ug/ml) mAb og 105 bestrålede antigenpræsenterende celler (PBMC'er - CD4+-celler) i forholdet 1:1 og 1:10. Efterforskerne vil måle proliferation via CFSE-fortynding i Teff-cellerne og cytokin-sekretion i SN'erne af cellekulturer for at bestemme, i hvilket omfang Treg-celler fra RRMS-patienter udviser nedsat suppression i sammenligning med HC'er. IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10, TGF-B og IL-4 cytokinmålingerne vil blive udført ved anvendelse af ELISA.

Mål 1.C. Bestem virkningerne af IL-7 på nTregs' suppressive funktion i RRMS.

Da vores foreløbige data har identificeret IL-7-induceret STAT5-phosphorylering og FOXP3-ekspression, såvel som IL-7 in vitro-induceret Treg-proliferation, vil efterforskerne korrelere serum-IL-7-niveauerne med Treg-tallene (% af CD4+-celler x totalt antal celler) og deres undertrykkende funktion, og undersøge effekten af ​​præ-inkubation af Tregs med dette cytokin til deres undertrykkende funktion.

Mål 2.A. Bestem fænotypen af ​​iTreg-celler i RRMS-patienter. Flowcytometriundersøgelser af IL-10+CD4+- og TGF-B+CD4+-celler afledt af RRMS-patienter og HC'er vil identificere sygdomsspecifik fænotype af iTregs, som kan afspejle funktionelle ændringer af iTregs i RRMS. Efterforskere vil undersøge de samme prøver fra kohorte af RRMS-patienter og HC'er, der er indskrevet i specifikt mål 1.A. Flowcytometriundersøgelser af de gatede CD4+IL-10+ og CD4+TGF-B+ celler vil blive udført ved brug af overflademarkørfarvning for CD39, CTLA-4, PD-1, ICOS, CD46, CD49b og LAG-3 og intracellulær farvning for FOXP3, IL-35, GZMB, pSTAT3, repressoren af ​​GATA-3 (ROG), aryl-carbonhydridreceptoren (AhR) og c-Maf-transkriptionsfaktorer.

Mål 2.B. Identificer mekanismerne for mangelfuld nTreg-induktion af iTregs i RRMS.

Suppressive assays vil blive udført som beskrevet i mål 1.B under anvendelse af CD4+CD25+CD127-Treg og CD4+CD25-CD127+ Teff-celler afledt af den fjerde kohorte på 10 HC'er og 10 RRMS-patienter. Efter 4 dages samdyrkning vil CD25+ Treg-celler blive fjernet ved hjælp af magnetiske perler, og de resterende CD4+CD25-celler vil blive bestrålet og genudpladet i et 1:10-forhold med autologe CD4+CD25-T-celler og stimuleret af plade -immobiliseret aCD3 og aCD28 mAb i yderligere 5 dage for at demonstrere den undertrykkende effekt af iTregs. Celleproliferation (målt ved 3[H]-inkorporering) og TGF-β- og IL-10-sekretion i SN'erne vil blive målt for at bestemme den iTreg-undertrykkende funktion induceret af CD4+CD25+CD127-Tregs i effektor-CD4+-cellerne. I den anden co-kultur vil efterforskerne også undersøge, i hvilket omfang iTreg-induktionen medieres via celle-til-celle-kontakt (blokeret af en permeabel membran) eller af opløselige cytokiner (blokeret af aIL-10, aTGF-B eller aIL) -4 mAb).

Mål 2.C. Karakteriser virkningen af ​​de iTreg-producerede immunregulerende cytokiner på rekonstitutionen af ​​immuntolerance.

Efterforskere vil måle IFN-y, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-9 og IL-10, TGF-B og IL-35 niveauerne i SN'erne af ovennævnte co-kulturer af iTregs og CD4+-celler afledt af RRMS-patienter og HC'er efter 48 timer. Efterforskerne vil måle ekspressionen af ​​MHC klasse I og II, CD80, CD86, CD40 og CD58 i de resterende PBMC-prøver opnået i Specifikt Aim 2B i 10 HC'er og 10 RRMS-patienter i CD19+-gatede B-celler, CD14+-gatede monocytter, og CD1c-gatede DC'er ved hjælp af flowcytometri, som rapporteret i vores tidligere undersøgelse 43. Efterforskerne vil undersøge, i hvilket omfang iTreg-tal og iTregs' IL-10 og TGF-B produktion samt IL-10 og TGF-B serumniveauer korrelerer med hæmningen af ​​MHC og costimulerende molekylers ekspression i B-celler, monocytter og DC'er hos HC'er og RRMS-patienter.