Jern og zink biotilgængelighed fra bioberigede kartofler

Undersøgelsestype og population Dobbeltblindt randomiseret forsøg med naturligt bioberigede kartofler, der skal udføres i Huancavelica, Perú. Det vil blive rekrutteret omkring 100 kvinder og 80 mænd i alderen 18-45 år, der bor i byen Huancavelica.

ETIK Ansøgninger blev indsendt og godkendt af Research Ethics Committee (REC) ved University of East Anglia Faculty of Medicine and Health (FMH) i Norwich (UK) og en REC fra Instituto de Investigacion Nutricional (IIN) i Peru.

Hver deltager vil blive fuldt informeret om alle procedurerne og vil få mulighed for at stille spørgsmål og modtage yderligere detaljer, som deltagerne har brug for.

Procedurerne (blodprøver, urinprøver, antropometri, kosttilbagekaldelse) vil blive forklaret for de personer, der accepterer at deltage i den indledende screening, og deltagerne vil blive opfordret til at underskrive den første samtykkeerklæring.

SPECIFIKKE METODER TIL JERNSTUDIE (Fase 1) Prøvestørrelse Undersøgelsen kræver en tilmelding af i alt 30 kvinder for at give mulighed for, at 33 %, der ikke overholder protokollen, kan nå en endelig stikprøvestørrelse på 20 kvinder. Efterforskerne vurderer, at efterforskerne muligvis skal screene omkring 100 kvinder.

Ernæringsstatus Som en del af screeningen vil alle potentielle kandidater blive vejet og målt ved hjælp af standardiseret udstyr.

Måling af fysisk aktivitet Alle deltagere vil blive bedt om at bruge en actigraph (et tri-aksialt accelerometer), som måler fysisk aktivitet (bevægelse) i tre dimensioner.

Blodprøve Et passende uddannet medlem af undersøgelsesteamet vil indsamle en venøs blodprøve (ca. 6 ml i et reagensglas med heparin) for at måle ferritin, hæmoglobin og CRP (screening og 3 gange mere: baseline, 16 og 40 dage efter første dag af kartoffelindtagelse).

Urinprøve Deltagerne vil blive bedt om at give en urinprøve (30 ml) til at udføre en graviditetstest med en teststrimmel.

Sociodemografisk og fødevaresikkerhedsundersøgelse Efterforskerne vil inkludere en socioøkonomisk undersøgelse, og ELCSA's fødevaresikkerhedsspørgeskema vil begge blive anvendt på alle tilmeldte deltagere.

Undersøgelsesprocedurer I henhold til resultaterne af screeningen og revisionen af ​​kriterierne for inklusion og eksklusion og efter information og verifikation af, at deltagerne forstår samtykkeerklæringen til jernundersøgelsen, vil forsøgspersoner blive inviteret til at deltage. Samtykkede deltagere vil blive tilfældigt tildelt til at indtage en eller anden af ​​de to typer kartoffel (bioberiget-A eller ikke-B). Den første kartoffelsort vil blive givet i løbet af de første 2 uger (dag 1-12) og den anden sekvens mellem dag 15-26 (i begge tilfælde eksklusive weekenddage lørdag og søndag). Kartoflerne bliver kogt i vand og tilbudt mos.

Der vil blive taget blodprøver ved 5 lejligheder, 1) ved screening for at verificere overholdelse af eksklusions- og inklusionskriterierne; derefter på dag 1 før deltagerne spiser den første type kartoffel, dag 15 før de spiser den anden type kartoffel, dag 26 efter at have spist alle begge kartoffeltyper og på dag 40 to uger efter at have spist alle kartoflerne.

Forbrug af kartoflen Hver deltager får serveret 500 g kartoffel fordelt på to portioner á 250 g hver. hver deltager tager, afhængigt af deres tildeling, 0,3 mg 57FeSO4 (Peruanita kartoffel) eller 0,3 mg 58FeSO4 (bioberiget kartoffel), fortyndet i 50 ml destilleret vand, som skal drikkes, mens deltagerne spiser kartoflen - halvvejs i måltid. Derudover vil hver deltager modtage 200 ml destilleret vand at drikke. Isotoperne vil blive leveret af ETH (Swiss Federal Institute of Technology i Zürich). Derudover er de isotoper, som efterforskerne vil bruge, stabile isotoper, dvs. deltagere findes naturligt i miljøet og udgør som sådan ingen risiko.

Indsamling af biologiske prøver til måling af jern ved hjælp af stabile isotoper Blodprøver vil blive indsamlet gennem hele interventionsperioden som tidligere beskrevet og vil blive sendt til ETH, Zürich, efter standard operationsprocedurer. Deltagerne vil blive informeret og give samtykke til overførsel og brug af deres prøver uden for Peru' med henblik på denne forskningsundersøgelse. Prøver vil blive anonymiseret og vil ikke blive transporteret med personlige identificerbare data.

Med hensyn til forarbejdning vil prøver blive blandet med NO3 og H2O2 og fordøjet i en mikrobølgeovn, efterfulgt af adskillelse af jernet fra blodmatrixen ved hjælp af udvekslings-anion-kromatografi og et opløsningsmiddel (fortynder) eller ekstraktion fra opløsningsmidlet ved hjælp af destilleret.

Isotoperne vil blive analyseret ved hjælp af et plasmakoblet induktivt multikollektor massespektrometer (Neptune; Thermo Finnigan). Mængden af ​​de mærkede jernisotoper 57Fe og 58Fe vil blive målt 14 dage efter indtagelse af begge typer kartoffel er afsluttet. Beregningen (af absorption) vil blive foretaget under hensyntagen til forsøgspersonernes estimerede blodvolumen baseret på vægt, højde og forsøgspersonens målte hæmoglobinkoncentration (i betragtning af gennemsnittet af den indledende og sidste blodprøve). Beregningen er baseret på princippet om isotopfortynding, idet man betragter som faktoren for jernisotopmarkøren frem for den monoisotopiske markør8. Til beregning af den absorberede fraktion vil efterforskerne antage 80% inkorporering af det absorberede jern.

SPECIFIKKE METODER TIL ZINKSTUDIE (Fase 2) Prøvestørrelse Undersøgelsen kræver en prøvestørrelse på 40 kvinder. Dette giver mulighed for et tab på 40 % for at nå en endelig total på 24 kvinder.

Procedurer I henhold til resultaterne af screeningen og efter at have kontrolleret, at deltagerne overholder alle inklusionskriterierne og ingen af ​​eksklusionskriterierne vil deltagerne blive inviteret til at deltage i zinkdelen af ​​undersøgelsen. For denne deltager vil få den anden samtykkeformular til at læse, og de, der accepterer og underskriver formularen, vil blive inviteret til at deltage i undersøgelsen.

De personer, der accepterer, vil blive tilfældigt fordelt til at spise en eller anden af ​​kartoffeltyperne (bioberiget-A eller nej-B). Alle deltagere får begge typer kartofler, men i forskellig rækkefølge, på denne måde vil hver deltager være deres egen kontrol. Den første kartoffelsort vil blive givet på dag 1, efter accept af deltagelse i undersøgelsen og efter accept og underskrift af samtykkeerklæringen for denne del: (forbrugsprotokol og anden sort spises 29 dage efter (rækkefølgen af ​​kartoffelsorter) vil blive tilfældigt tildelt).

Efterforskerne vil tage blodprøver ved tre lejligheder: indskrivning og dag 1 og 29 (de dage, hvor deltagerne spiser kartoflen) efter faste i 8 timer (mad) og 6 timer (væsker).

Undersøgelsesmålinger Antropometri Som en del af screeningen vil alle potentielle kandidater blive vejet og målt ved hjælp af standardiseret udstyr. Efter deres vægt og BMI vil efterforskerne afgøre, om deltagerne er kvalificerede.

Samtykkede deltagere vil blive bedt om at give en venøs blodprøve (ca. 10 ml i et reagensglas med heparin). Plasma og pakkede røde blodlegemer vil blive udtaget fra blodprøverne og opbevaret ved <18oC.

Urinprøve Deltagere med samtykke giver en urinprøve (30 ml) som en del af screeningsfasen for at udføre en graviditetstest. På dag 1, 3, 4, 5, 6, 7, 29, 32, 33, 34, 35 og 36 vil efterforskerne indsamle urinprøver for at analysere zinkindholdet. Hver dag skal efterforskerne have 100 ml urin, opsamlet om morgenen (mellem klokken 7-12 om morgenen).

Forbrug af kartoflen Forsøgspersonerne får i alt 1000 g kartoffel fordelt på to 500 g portioner. Den første portion gives, mens deltagerne faster (mindst 8 timer til mad og 6 timer til drikke) og i to separate portioner (hver på 250 g). Når deltagerne har spist den første portion på 250 g, vil forsøgspersonen modtage 0,25 mg 67Zn fortyndet i 50 ml flaskevand, og derefter vil deltagerne modtage den anden portion kartoffel. To timer senere vil deltagerne modtage en intravenøs infusion af 70Zn (200 ug) fortyndet i 50 ml flaskevand. Efter yderligere 2 timer vil deltagerne modtage de to andre portioner kartoffel, og som før vil deltagerne efter den første servering modtage 0,25 mg 67Zn fortyndet i 50 ml flaskevand. I denne periode og i 3 timer efter den anden portion kartoffel vil forsøgspersonen ikke indtage mad eller væske, undtagen vand, som deltagerne vil få. Hvert forsøgsperson vil modtage 200 ml vand til hvert måltid og 200 ml vand mellem måltiderne. I øjeblikket er isotoper den bedste metode til at måle optagelsen af ​​zink. Derudover er de isotoper, der vil blive brugt, stabile isotoper, det vil sige, at deltagere eksisterer naturligt i miljøet og udgør ingen risiko. Ingen mad eller drikke må indtages i mindst 3 timer efter at have spist den sidste portion kartoffel.

Blodprøver til måling af zink Efterforskerne vil tage i alt tre blodprøver i alt. Absorption ved hjælp af stabile isotoper (dag 29) Blodprøverne, der er blevet indsamlet, sendes til ETH, Zürich. ETH vil foretage analysen af ​​CRP for zink. CRP vil blive målt ved hjælp af et ELISA-kit. Plasmazinkkoncentrationen vil blive målt ved induktionsplasmakoblet massespektrometri.

Urinprøver til måling af zink ved hjælp af stabile isotoper. Urinprøver vil blive koncentreret ved frysetørring og derefter mineraliseret ved fordøjelse i en mikrobølgeovn (MLS-Turbowave; MLS GmbH) under anvendelse af en blanding af HNO3 og zink isoleret fra mastermatrixen ved ionbytning kromatografi. Efterforskerne vil bruge ultrarene syrer til forberedelsen af ​​prøverne.

Bestemmelse af zinkabsorption Blod- og zinkisotopsammensætning vil blive analyseret i to eksemplarer på ETH Human Nutrition Laboratory. Urinprøver vil blive mineraliseret ved mikrobølgefordøjelse (MLS-ETHOS plus; MLS GmbH) ved hjælp af en blanding af HNO3 og H2O2 og zink isoleret fra prøvematrixen ved ionbytterkromatografi (Wegmuller et al 2014). Alle syrer, der anvendes til forberedelse af prøver, vil være ultrarene. 70Zn:66Zn og 67Zn:66Zn isotopforhold vil blive målt for at bestemme 70Zn og 67Zn berigelse i urinprøverne ved at bruge et højopløsnings dobbeltfokuserende magnetisk sektorfelt multi-kollektor induktivt koblet plasma massespektrometer (Finnigan Neptun; Thermo Electron). 12 Fraktionel absorption af 67Zn-dosen fra testmåltiderne vil blive beregnet ved at bruge den orale til i.v. tracers ratio-metode anvendt til spot-urinprøver ifølge principper beskrevet af Friel et al.

7-dages madregistrering Ved at bruge metoden til at registrere alle fødevarer spist over en 7-dages periode kan efterforskerne få information om alle fødevarer spist på en uge (inklusive lørdag og søndag). For at opnå dette vil efterforskerne bede forsøgspersonerne om at lave en registrering af alle indtaget fødevarer, detaljer om madlavning og alle drikkevarer (inklusive vand), som deltagerne har spist eller drukket. Deltagerne skal notere det måltid, hvor maden og drikkevaren blev indtaget, og den tid, det tager at spise det (morgenmad, frokost, aftensmad og mellem måltiderne (snacks) og mængden, der blev spist på hvert tidspunkt af dagen. For at gøre dette vil efterforskerne give forsøgspersonerne en tablet, hvori de kan registrere forbruget/måltiderne og også tage et billede af al den spiste mad.

SPECIFIKKE METODER TIL KONSEKVENSVURDERING Data om kostindtag, serumferritin og biotilgængelighed af jern vil blive brugt til to modelleringsmetoder. For det første vil efterforskerne anvende metoden Disability Adjusted Life Year (DALY), som er en passende metode til at estimere ernæringsmæssige og sundhedsmæssige virkninger af bioberigede afgrøder. Dette vil bygge på modeller, der er udviklet i fællesskab af CIP og IIN, der har lavet antagelser om jern og zink biotilgængelighed fra kartofler. For det andet vil efterforskerne bruge data om sædvanligt jernindtag, serumferritinkoncentrationer og beregnede fysiologiske krav til jern til at tilpasse et modelestimat biotilgængelighed af jern i kosten i Europa, Andeshøjlandet og mere generelt til lav- og mellemindkomstlande.